李文靜, 楊桂霞, 周賢軒, 陳婷婷, 石春紅

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

基因敲除技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物、微生物,利用Red同源重組系統(tǒng)可以達(dá)到基因敲除、引入、替換等遺傳學(xué)修飾的目的[1]。Red同源重組系統(tǒng)指λ噬菌體基因組中包含一個(gè)Red重組編碼區(qū)段,可啟動(dòng)外源性DNA和細(xì)菌染色體的同源重組[2]。導(dǎo)入細(xì)菌的DNA片段與染色體的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組,將目的基因置換下來(lái),以達(dá)到基因敲除的目的。

反選擇標(biāo)記基因與正選擇標(biāo)記基因相反,含有反選擇標(biāo)記基因的細(xì)菌在特定的篩選條件下不能存活,反之則可以存活,從而在不引入抗性基因的情況下達(dá)到篩選目的。利用Red同源重組技術(shù),結(jié)合正反向選擇標(biāo)記基因的雙重選擇作用,可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組中基因的敲除與回補(bǔ)[3-5]。

本文構(gòu)建的tetA-sacB是一種具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的兩步反選擇系統(tǒng)。位于細(xì)胞質(zhì)膜中的tetA基因產(chǎn)物可以阻止四環(huán)素在細(xì)胞中積累,從而產(chǎn)生四環(huán)素抗性，還會(huì)使細(xì)胞對(duì)鐮刀菌酸等親脂性螯合劑敏感[6]，因此tetA基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有正反2個(gè)方面的選擇效應(yīng)[7]。sacB基因是編碼果聚糖蔗糖酶的枯草芽孢桿菌基因,可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖,果聚糖在周質(zhì)中積累,會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)起抑制作用[8-9]。tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)如圖1所示。通過(guò)基因工程技術(shù)將這2個(gè)基因構(gòu)建到一個(gè)自殺質(zhì)粒中,該質(zhì)粒含有tetA-sacB雙基因盒,在細(xì)菌基因的敲除與回補(bǔ)過(guò)程中可以利用正反選擇作用進(jìn)行篩選。

圖1 不同基因敲除方法的比較

由圖1a可知,帶有抗性基因的DNA片段在同源序列H1和H2的引導(dǎo)下,可以用來(lái)進(jìn)行基因敲除,但無(wú)法實(shí)現(xiàn)后續(xù)基因回補(bǔ)的篩選。由圖1b可知,含有tetA-sacB的雙基因盒中每個(gè)基因產(chǎn)物都發(fā)揮獨(dú)立的作用,可以用于基因敲除的篩選;而且,含有鐮刀菌酸和蔗糖的培養(yǎng)基對(duì)攜帶tetA和sacB基因的細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用,可以通過(guò)這種抑制作用進(jìn)行反向篩選,該雙重選擇系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)性強(qiáng)。

本文使用遺傳背景清楚且易于進(jìn)行遺傳學(xué)操作的大腸桿菌MG1655,通過(guò)Red同源重組系統(tǒng)結(jié)合tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組基因的敲除與回補(bǔ),證明了該雙重選擇系統(tǒng)的可行性與選擇的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pDNR-LIB、pAH162、pKD46,由本實(shí)驗(yàn)室保存;大腸桿菌菌株BW25142和大腸桿菌MG1655均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR購(gòu)于Takara公司;Taq DNA聚合酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;SanPrep 柱式質(zhì)粒 DNA 小量抽提試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司;凝膠及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)回收試劑盒購(gòu)于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ購(gòu)于NEB有限公司;其他試劑均為分析純;引物設(shè)計(jì)采用Vector NTI軟件,由通用生物(安徽)股份有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1所列。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物

表1中帶有下劃線的表示酶切位點(diǎn)或同源臂序列。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒pAH162-sacB的構(gòu)建

以質(zhì)粒pDNR-LIB為模板,使用引物P0493、P0494擴(kuò)增sacB及其啟動(dòng)子,以限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ分別雙酶切sacB片段和質(zhì)粒pAH162。將sacB及其啟動(dòng)子連接到pAH162的BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)之間,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BW25142化學(xué)感受態(tài)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證引物為P0493和P0028。從保存的陽(yáng)性菌株中提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建含有tetA-sacB雙基因盒的質(zhì)粒pAH162-sacB。

1.2.2 大腸桿菌MG1655中l(wèi)acZ基因的敲除

利用λRed同源重組系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除。從構(gòu)建的質(zhì)粒pAH162-sacB中擴(kuò)增帶有l(wèi)acZ基因上下游同源臂的tetA-sacB片段,擴(kuò)增引物為P0554、P0555。將tetA-sacB片段通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化至攜帶溫敏性輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌MG1655電感細(xì)胞中,該步為正向選擇,通過(guò)四環(huán)素抗性篩選陽(yáng)性克隆。使用引物P0565、P0566、P0567、P0568進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,保存篩選到的陽(yáng)性菌種MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。

1.2.3lacZ基因回補(bǔ)

以大腸桿菌MG1655為模板,使用引物P0565、P0568擴(kuò)增帶有同源臂的lacZ基因。將lacZ基因電擊轉(zhuǎn)化至MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB電感細(xì)胞中,通過(guò)同源重組替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB中的tetA-sacB片段。在含有鐮刀菌酸和蔗糖的反選培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.4tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng)

tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng)使用反選擇培養(yǎng)基。100 mL的tetA/sacB反選擇固體培養(yǎng)基含有1.5 g瓊脂,0.4 g胰蛋白胨,0.4 g酵母提取物,0.8 g氯化鈉,0.7 g磷酸二氫鉀,11.0 mg氯化鋅,2.4 mg鐮刀菌酸,6.0 g蔗糖。lacZ基因通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化至MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB電擊感受態(tài)中。加入LB復(fù)蘇后的菌液轉(zhuǎn)接至50 mL上述液體反選培養(yǎng)基中,42 ℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)[10]。蘸取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液劃線于反選固體培養(yǎng)基,42 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證,利用tetA對(duì)鐮刀菌酸的敏感性和sacB對(duì)蔗糖敏感性的反向選擇作用篩選陽(yáng)性克隆。

1.2.5β-半乳糖苷酶活性分析

將野生型菌株MG1655、敲除菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB以及回補(bǔ)菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB(Comp)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析[11]。3種菌株于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),按體積分?jǐn)?shù)1%接入3 mL新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取相應(yīng)菌液量接入新鮮培養(yǎng)基至總體積為3 mL,37 ℃振蕩培養(yǎng)約6 h。取一部分菌液測(cè)OD600,一部分菌液做β-半乳糖苷酶活性分析，每種菌株設(shè)置3個(gè)平行,取300 μL菌液于12 000 r/min離心2 min,棄上清。加入500 μL Z-buffer工作液,30 μL 0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS),50 μL氯仿,混勻后于30 ℃水浴5 min。加100 μL 2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),開(kāi)始計(jì)時(shí),當(dāng)溶液開(kāi)始變黃色,加入250 μL 1 mol/L Na2CO3,停止計(jì)時(shí)。12 000 r/min離心10 min,測(cè)上清液的OD420,利用公式(1 000×OD420)/(反應(yīng)時(shí)間×菌液體積×OD600),計(jì)算β-半乳糖苷酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pAH162-sacB構(gòu)建分析

若將反選擇標(biāo)記基因sacB構(gòu)建到pAH162中,則重組質(zhì)粒pAH162-sacB含有tetA-sacB雙基因盒,該雙基因盒可以在細(xì)菌基因組的基因敲除與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中起雙重選擇作用。構(gòu)建質(zhì)粒pAH162-sacB結(jié)果如圖2所示。

由圖2a可知,質(zhì)粒pAH162含有tetA基因,質(zhì)粒pDNR-LIB含有sacB基因,以pDNR-LIB為模板擴(kuò)增sacB及其啟動(dòng)子片段,通過(guò)酶切連接的方法將sacB及其啟動(dòng)子構(gòu)建到pAH162的BamHⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)之間。

圖2b中：M為DNA Marker；泳道1為不加模板的空白對(duì)照；泳道2為擴(kuò)增的sacB基因及其啟動(dòng)子,條帶大小為2 071 bp。由圖2b可知，將酶切連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BW25142,對(duì)轉(zhuǎn)化板上的單克隆進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2c所示。圖2c中：M為DNA Marker;泳道1為pAH162對(duì)照;泳道2～9為轉(zhuǎn)化板上的單克隆PCR驗(yàn)證結(jié)果,陽(yáng)性菌株中引物P0493可以與引物P0028配對(duì),應(yīng)有2 891 bp的目的條帶。由圖2c可知,泳道3、4、6 與預(yù)期符合,為陽(yáng)性克隆,泳道5、7、8、9為陰性克隆。提取陽(yáng)性菌株質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明重組質(zhì)粒pAH162-sacB構(gòu)建成功。

圖2 質(zhì)粒pAH162-sacB構(gòu)建結(jié)果分析

2.2 大腸桿菌MG1655中l(wèi)acZ基因的敲除分析

利用tetA-sacB片段替換大腸桿菌MG1655中的lacZ基因,通過(guò)tetA基因產(chǎn)物表達(dá)的四環(huán)素抗性篩選陽(yáng)性克隆。敲除大腸桿菌MG1655中的lacZ基因結(jié)果如圖3所示。圖3b中：M為DNA Marker；泳道1為大腸桿菌MG1655陰性對(duì)照,條帶大小為3 607 bp;泳道2、3為陽(yáng)性克隆,分別用引物P0565/P0566、引物P0567/P0568擴(kuò)增出的目的條帶,符合預(yù)期。陽(yáng)性菌株保存于-80 ℃。

由圖3a可知,以pAH162-sacB為模板,擴(kuò)增帶有l(wèi)acZ基因上下游同源臂(H1和H2)的tetA-sacB基因片段,用tetA-sacB替換lacZ基因。敲除成功的陽(yáng)性克隆基因攜帶tetA基因,從而具有四環(huán)素抗性,可以利用四環(huán)素抗性進(jìn)行正向篩選。由圖3b可知,陽(yáng)性克隆中引物P0565/P0566配對(duì),P0567/P0568配對(duì),可以分別擴(kuò)增出2條大小為651、2 081 bp的特異性條帶。

圖3 大腸桿菌MG1655中l(wèi)acZ基因的敲除分析

2.3 lacZ基因回補(bǔ)分析

由于含有鐮刀菌酸與蔗糖的培養(yǎng)基對(duì)攜帶有tetA-sacB基因片段的細(xì)菌生長(zhǎng)有強(qiáng)烈的抑制作用。在回補(bǔ)lacZ基因的實(shí)驗(yàn)中,可以利用tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng)的反向選擇作用篩選陽(yáng)性克隆，回補(bǔ)lacZ基因的結(jié)果如圖4所示。

圖4 lacZ基因的回補(bǔ)分析

由圖4a可知,以大腸桿菌MG1655為模板擴(kuò)增lacZ基因,替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB中的tetA-sacB基因片段,在含有鐮刀菌酸和蔗糖的反選培養(yǎng)基上篩選,實(shí)現(xiàn)lacZ基因的回補(bǔ)。

圖4b中,M為DNA Marker;泳道1、2分別為陰性對(duì)照MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB通過(guò)P0565/P0566和P0567/P0568(圖3a)擴(kuò)增出的條帶;泳道3為MG1655陽(yáng)性對(duì)照;泳道4為成功回補(bǔ)lacZ基因的單克隆PCR結(jié)果,符合預(yù)期。保存陽(yáng)性菌株于-80 ℃。

2.4 β-半乳糖苷酶活性分析

在大腸桿菌中,lacZ基因編碼合成了β-半乳糖苷酶。為了進(jìn)一步驗(yàn)證敲除菌株及回補(bǔ)菌株結(jié)果的可靠性,本文進(jìn)行了β-半乳糖苷酶活性分析。β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果如圖5所示,圖5中：A為野生型大腸桿菌MG1655;B為敲除菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB;C為回補(bǔ)菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。

由圖5可知,MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB因缺失lacZ基因,因此沒(méi)有β-半乳糖苷酶活性;野生型MG1655和回補(bǔ)菌株均表達(dá)較高的β-半乳糖苷酶活性,且無(wú)顯著差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用tetA-sacB的雙重選擇作用,實(shí)現(xiàn)了lacZ基因的敲除與回補(bǔ)。

圖5 菌株β-半乳糖苷酶活性分析

3 討 論

Red同源重組系統(tǒng)利用可正向選擇的抗生素抗性基因替換目標(biāo)基因,實(shí)現(xiàn)細(xì)菌基因組中非致死基因的敲除[12]。抗性基因的正向選擇只適合基因敲除,不適合篩選基因組中非必須基因的回補(bǔ),對(duì)驗(yàn)證基因功能的相關(guān)研究不利。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA(sgRNA)組成,在sgRNA的向?qū)峦ㄟ^(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,利用Cas9蛋白對(duì)基因組進(jìn)行剪切,使DNA雙鏈斷裂,實(shí)現(xiàn)基因敲除[13]。然而sgRNA的設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)、Cas蛋白和sgRNA的遞送等在一些情況下限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用[14]。

本文將構(gòu)建的tetA-sacB雙基因盒用于基因敲除，而共同表達(dá)2種反選擇標(biāo)記基因tetA和sacB可以實(shí)現(xiàn)回補(bǔ)菌株的反向選擇。tetA基因可以作為正向標(biāo)記基因,表達(dá)四環(huán)素抗性，同時(shí)tetA基因還可以用作反向篩選標(biāo)記,含有鐮刀菌酸的培養(yǎng)基對(duì)攜帶tetA基因的細(xì)菌有致死作用,但是菌株篩選的陽(yáng)性率較低[15]。sacB基因不需要抗生素抗性誘導(dǎo)細(xì)菌死亡[16],而是通過(guò)菌株對(duì)蔗糖的敏感性發(fā)揮反向篩選作用。sacB基因編碼胞外果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶,導(dǎo)致果聚糖富集,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。本文使用構(gòu)建的tetA-sacB雙基因盒敲除大腸桿菌MG1655中l(wèi)acZ基因,利用tetA基因產(chǎn)物表達(dá)的四環(huán)素抗性進(jìn)行了正向選擇;在回補(bǔ)lacZ基因的過(guò)程中,利用tetA和sacB的反選擇作用進(jìn)行篩選,陽(yáng)性率高。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒pAH162-sacB,將2種反選擇標(biāo)記基因tetA和sacB構(gòu)建到一個(gè)雙基因盒,建立tetA-sacB雙重選擇系統(tǒng)。擴(kuò)增tetA-sacB片段敲除大腸桿菌MG1655中的lacZ基因,通過(guò)四環(huán)素抗性正向選擇陽(yáng)性克隆,成功篩選到陽(yáng)性菌株MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB。將lacZ基因原位回補(bǔ)替換MG1655ΔlacZ∶∶tetA-sacB菌株中的tetA-sacB基因片段,利用tetA和sacB的反向選擇作用,在含有鐮刀菌酸和蔗糖的培養(yǎng)基上成功篩選到回補(bǔ)菌株。β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果表明，野生型菌株和回補(bǔ)菌株能夠表達(dá)β-半乳糖苷酶活性,且彼此間無(wú)差異,而敲除菌株因缺失lacZ基因,無(wú)β-半乳糖苷酶活性。本文利用tetA-sacB的正反選擇作用,成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌MG1655中l(wèi)acZ基因的敲除與回補(bǔ),表明該雙重選擇系統(tǒng)選擇的有效性,可以應(yīng)用到大腸桿菌的基因工程研究中,對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行遺傳學(xué)修飾。