孫雪蓮，楊佳楠，姜同連，朱福彬，于閃閃，李 響，2，李洪志，2△

（1北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林 132000；2吉林省腎臟病基因測序精準醫(yī)療創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132000）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由非酒精因素引起的肝臟內脂肪蓄積或脂肪合成、利用失衡的一類肝臟疾病總稱［1］。臨床表現(xiàn)范圍廣泛，從無癥狀的肝臟脂肪變性到更為嚴重的非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝癌，常見于糖尿病和代謝綜合征患者［2］。對NAFLD的治療常采用胰島素增敏劑、腸促胰島素藥物、減肥降脂藥物以及減脂手術和極少的肝移植手術等方法［3］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種由18～25個核苷酸組成的非編碼RNA，參與調節(jié)眾多生物學功能，包括細胞增殖、蛋白質分泌、脂質代謝、細胞炎癥和生存［4］。我們前期的研究證明，miR-23b可以通過調控靶 基 因ACOT4改 善NAFLD［5］。而miR-23a是 否 在NAFLD中發(fā)揮作用還不明確。本研究通過高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導miR-23a-3p基因敲除（miR-23a KO）小鼠，建立NAFLD模型，驗證miR-23a-3p對小鼠肝臟沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）/叉 頭 框 蛋 白O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）信號通路的調控作用，以期為NAFLD研究提供一定參考。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠20只，體重20～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006；miR-23a KO小鼠訂購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司［許可證號為SCXK（蘇）2018-0008；miR-23a KO雜合子小鼠合籠后，通過基因型鑒定篩選子代純合子繼續(xù)繁育，選取雄性純合子小鼠，8周齡，體重在20～24 g之間用于實驗］；db/db小鼠肝臟組織存放于本實驗室-80℃冰箱；高脂飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。小鼠繁殖、飼養(yǎng)和基因型鑒定在北華大學基礎醫(yī)學院吉林省腎臟病基因測序精準醫(yī)療科技創(chuàng)新中心動物室完成。實驗所用動物經北華大學動物倫理委員會批準，并按《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用辦法》進行。

2 主要試劑

L-02和HepG2細胞株購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；miR-23a-3p類似物及檢測試劑盒購自廣州銳博生物有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；引物序列購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA提取試劑盒購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒SYBR Green Master Mix購自Roche；pmirGLO Dual-Luciferase載體及Dual-Luciferase?Reporter Assay System購 自Promega；SIRT1、FOXO1和Ac-FOXO1抗體購自Abcam；AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK和過氧化物酶體增殖物激活受體α

（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）抗體購自Cell Signaling Technology；β-actin抗體和Ⅱ抗購自北京博奧森生物技術有限公司；油紅O染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 動物造模與分組實驗動物分4組：野生型（wild-type，WT）C57BL/6小鼠正常飲食（normal diet，ND）組和HFD組及miR-23a KO小鼠ND組和HFD組，每組10只。各組小鼠自由飲水進食，分籠飼養(yǎng)在明暗各12 h、22～26℃的標準動物室。8周齡時給予高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD模型，持續(xù)喂養(yǎng)12周，定期記錄體重變化。20周齡時，依據文獻NAFLD動物模型標準［6］，篩選符合實驗要求的動物（WT和miR-23a KO小鼠各6只），禁食不禁水12 h，次日上午稱重，腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，眼底靜脈竇取血，1 200×g離心15 min，分離血清保存于-80℃冰箱。分離肝臟組織，記錄肝臟重量，一部分保存于-80℃冰箱，一部分用于形態(tài)學染色固定于10%的甲醛溶液中備用。肝臟指數（%）=肝臟濕重（g）/體重（g）×100%。

3.2 qPCR檢測基因表達量用RNA提試劑盒提取肝臟細胞和組織總RNA，按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。采用qPCR法檢測肝臟細胞和組織中miR-23a-3p的表達情況以及HFD后小鼠肝臟中與脂代謝有關基因的表達情況。引物序列見表1。反應體系（20 μL）：cDNA 2 μL，2×SYBR Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 6 μL。qPCR條件：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，45個循環(huán)；72℃5 min。采集循環(huán)退火后的熒光信號。

3.3 HE染色和油紅O染色肝臟組織的HE染色：經10%的甲醛溶液固定后，經脫水、包埋處理，制作4 μm石蠟切片，經過烘片、脫水、二甲苯、梯度乙醇、蘇木素-伊紅染色，中性樹脂封片拍照。油紅O染色：肝臟組織制作4 μm冰凍切片，按照油紅O染色試劑盒說明進行操作，甘油封片，拍照。

3.4 生化指標檢測血清中脂質指標（TC、TG、HDL-C和LDL-C）及肝功能指標（ALT和AST）按照試劑盒說明利用酶標儀法進行檢測。

3.5 雙螢光素酶報告基因實驗利用PCR方法，根據NCBI數據庫小鼠SIRT1基因序列信息，設計3′-UTR擴增引物，以正常小鼠mRNA逆轉錄的cDNA為模板擴增3′-UTR序列，測序正確后連接到pmirGLO Dual-Luciferase載體中，轉染293T細胞后按照Dual-Luciferase?Reporter Assay System說明進行熒光值的測定。

3.6 Western blot檢測取肝臟組織80 mg，盡量剪碎，加入適量PMSF裂解液和0.5 mm鋯珠，利用組織研磨機勻漿3 min，至于冰上10 min，4℃、10 000×g離心10 min。取上清用BCA試劑盒蛋白定量；取30 μg蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合煮沸8 min后進行SDS-PAGE，并轉移至PVDF膜；2% BSA室溫封閉1 h，PBST洗膜；Ⅰ抗4℃孵育過夜，PBST洗膜；加入對應的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜后進行ECL顯影。采用Image Lab軟件進行灰度值分析。

4 統(tǒng)計學處理

本實驗所得到的數據應用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析，計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 動物和細胞模型中miR-23a-3p的表達變化

C57BL/6小鼠給予HFD 12周后，通過qPCR檢測肝臟中miR-23a-3p的表達情況，結果如圖1A顯示，與ND（WT）組相比較，HFD（WT）組miR-23a-3p的表達顯著升高（P＜0.01），同樣，5月齡db/db小鼠的肝臟中miR-23a-3p的表達也顯著高于ND（WT）組（P＜0.01）；在對L-02和HepG2細胞通過棕櫚酸油酸誘導后，與正常組對比，miR-23a-3p的表達同樣顯著升高（P＜0.05），見圖1B。

Figure 1.Expression of miR-23a-3p in animal（A）and cellular（B）models of fatty liver.ND：normal diet；HFD：high-fat diet；WT：wild-type；PA：palmitic acid；OA：oleic acid.Mean±SD.**P＜0.01 vs ND（WT）group；△P＜0.05 vs control group.圖1脂肪肝動物模型與脂肪肝細胞模型中miR-23a-3p的表達

為驗證基因敲除是否成功，對miR-23a KO小鼠主要組織器官miR-23a-3p表達水平進行檢測，結果顯示，與WT組比較，miR-23a KO小鼠各組織器官miR-23a-3p表達均顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 miR-23a KO小鼠器官組織中miR-23a-3p的表達Table 2.Expression of miR-23a-3p in miR-23a KO mice（Mean±SD.n=10）

2 HFD對miR-23a KO小鼠體重、肝臟臟器系數和肝臟形態(tài)學的影響

各組小鼠的體重變化如圖2A所示，與ND（WT）組比較，HFD（WT）組小鼠體重顯著升高（P＜0.01）；與HFD（WT）組比較，HFD（miR-23a KO）組小鼠的體重顯著降低（P＜0.01）。肝臟指數統(tǒng)計結果見圖2B，與ND（WT）組比較，HFD（WT）組小鼠的肝臟指數顯著升高（P＜0.01）；與HFD（WT）組比較，HFD（miR-23a KO）組小鼠的肝臟指數顯著降低（P＜0.05）。而與ND（WT）組比較，ND（miR-23a KO）組小鼠體重和肝臟指數均無顯著變化。

HE染色顯示，ND（WT）組肝臟組織形態(tài)學正常，肝細胞分界明顯，細胞核圓而清晰；而HFD（WT）組出現(xiàn)肝細胞索紊亂，細胞腫脹，胞質疏松，可見大量脂肪空泡；HFD（miR-23a KO）組肝細胞內脂滴減少，大部分接近正常形態(tài)。油紅O染色顯示，ND（WT）組小鼠肝細胞內未見明顯深紅色脂滴；而HFD（WT）組視野內可見大面積彌漫性的深紅色脂滴蓄積；與HFD（WT）組比較，HFD（miR-23a KO）組肝臟組織脂滴沉積明顯減少，脂質蓄積減輕。見圖2C。

3 HFD對miR-23a KO小鼠肝功能相關生化指標的影響

肝功能相關生化指標檢測結果顯示，與ND（WT）組比較，HFD（WT）組小鼠血清TC、TG、AST、ALT和LDL-C水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與HFD（WT）組小鼠比較，HFD（miR-23a KO）組小鼠血清TC、TG、AST和LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05），ALT降低趨勢不顯著，見圖3。

4 miR-23a KO小鼠肝臟組織中脂代謝相關基因表達水平

Figure 2.The body weight（A），liver index（B）and liver morphological changes（C）of mice in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs ND（WT）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HFD（WT）group.圖2高脂飲食后各組小鼠體重、肝臟系數及肝臟形態(tài)學變化

qPCR結果顯示，與ND（WT）組比較，HFD（WT）組Srebp1、Fas、Pparγ和Acc1的mRNA水平顯著升高（P＜0.05），Pparα和Cpt1的mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與HFD（WT）組比較，HFD（miR-23a KO）組Srebp1、Fas、Pparγ和Acc1的mRNA水 平顯 著降 低（P＜0.05），Cpt1的mRNA水平顯著升高（P＜0.05），而Pparα的mRNA水平升高趨勢不顯著，見圖4。

5 雙螢光素酶報告基因實驗證明miR-23a-3p靶定SIRT1基因

通過TargetScan數據庫（http://www.targetscan.org/.）預測發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p可以與SIRT1的3′-UTR序列反向互補結合，見圖5A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-23a-3p模擬物顯著抑制了螢光素酶的活性，而當SIRT13′UTR中的結合位點發(fā)生突變時，這種抑制完全消失，見圖5B。

6 miR-23a KO影響SIRT1/FOXO1通路

將各組實驗小鼠肝臟中總蛋白進行Western blot檢測，結果如圖6所示，與HFD（WT）組比較，HFD（miR-23a KO）組SIRT1和PPARα表達顯著增加（P＜0.05），p-AMPK/AMPK比值顯著升高（P＜0.05），而Ac-FOXO1/FOXO1比值顯著降低（P＜0.01）。

討 論

隨著人們生活水平的提高和生活習慣、飲食結構等因素的改變，NAFLD逐漸成為一種全球性高發(fā)病率的代謝性綜合征，最終可能導致肝臟纖維化、肝硬化或肝細胞癌的發(fā)生，而且有低齡化的趨勢，并與高脂血癥、肥胖等密切相關［7］。研究表明，肝臟中的脂肪堆積引起氧化應激或炎癥細胞因子的釋放，從而導致脂肪性肝炎、纖維化，甚至非酒精性脂肪性肝炎［2］。因此，迫切需要探索能夠抑制NAFLD中脂質積累的有效治療方案。在本研究中，我們指出抑制miR-23a-3p的表達可以緩解高脂誘導的肝臟脂質的積累，進而減弱NAFLD小鼠模型的肝損傷，為研究NAFLD的發(fā)病機制提供新線索。

Figure 3.Effects of high-fat diet（HFD）on biochemical indexes of liver function in miR-23a-3p knockout（miR-23a KO）mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs ND（WT）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HFD（WT）group.圖3高脂飲食對miR-23a-3p基因敲除小鼠肝功能的影響

Figure 4.The mRNA expression of lipid metabolism-related genes in mouse liver tissues.The mRNA levels of the genes involved in lipid anabolism，including Srebp1，F(xiàn)as，Pparγ，Pparα，Acc1 and Cpt1，were detected by qPCR.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ND（WT）group；#P＜0.05 vs HFD（WT）group.圖4小鼠肝臟組織中脂代謝相關基因的mRNA表達

Figure 5.Dual-luciferase reporter assay to validate the targeting of miR-23a-3p to SIRT1.A：sequence diagram of target gene loci；B：wild-type SIRT1 3′-UTR（3′-UTR WT）and mutant SIRT1 3′-UTR（3′-UTR Mut）constructs were inserted into pmir-GLO plasmid and co-transfected with miR-23a-3p into 293T cells，and then the luciferase activity was quantified.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖5雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-23a-3p與SIRT1的靶向關系

Figure 6.Relative protein levels of SIRT1，p-AMPK/AMPK，Ac-FOXO1/FOXO1 and PPARα in hepatic tissues of mice in different groups were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HFD（WT）group.圖6 Western blot檢測肝臟組織中SIRT1、p-AMPK/AMPK、Ac-FoxO1/FoxO1及PPARα的蛋白水平

以往研究證實，一些miRNAs包括miR-21、miR-27a、miR-34a和miR-122等，在NAFLD中發(fā)揮一定的調控作用。miR-21在NASH患者的肝臟組織中高表達［4］，抑制miR-21可以減少肝細胞損傷和纖維化的發(fā)生；miR-27a通過抑制PPARg抑制 脂 肪 生成［8］；miR-34a是肝臟中對脂質代謝調控最靈敏的miRNA之一，沉默miR-34a導致SIRT1和PPARα表達增加，從而改善肝臟脂肪變性［9］；miR-122是肝臟中表達豐度較高的miRNA［4］，NASH患者miR-122水平顯著低于正常人，通過沉默miR-122，使FAS、SREBP-1c和SREBP-2表達增加。而miR-23a和miR-23b是miR-23～27～24-2超家族成員，miR-24和miR-27皆參與脂質代謝的調控。我們前期研究證實，抑制或敲除miR-23b可以誘導小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪堆積，在糖尿病肥胖db/db小鼠體內過表達miR-23b能夠逆轉肝臟炎性的改變和纖維化程度，并證實miR-23b可以通過靶定ACOT4進而調控NAFLD進展［5］。Li等［10］證實miR-23a/b-3p可以通過調節(jié)SREBP-1c和FAS促進肝臟脂質積累，但實驗對象存在一定局限，以HFD喂養(yǎng)C57BL/6小鼠、db/db小鼠和細胞實驗開展，沒有涉及基因敲除動物模型。在本研究中，我們構建和繁育miR-23a KO小鼠作為研究對象，對其進行HFD誘導，結果顯示miR-23a KO后肝臟脂肪積累減少，同時肝臟生化指標得到改善，脂代謝相關基因Srebp1、Fas、Pparγ、Acc1、Pparα和Cpt1發(fā)生顯著改變，這些結果進一步表明，miR-23a-3p在調控肝臟脂肪細胞分化方面發(fā)揮著重要作用。

SIRT1是脂質代謝和糖代謝中關鍵的調節(jié)分子之一，它可以改善肝臟和其他組織的胰島素敏感性，并減輕肝臟脂肪發(fā)生變性［11］。本研究中，HFD誘導后，相比于WT，miR-23a KO小鼠SIRT1表達上調，并伴隨脂質積累減少。SIRT1參與預防肝臟脂肪變性已有相關研究報道，并證實SIRT1的表達水平在NAFLD患者中下降［12］。通過雙螢光素酶實驗我們證實了miR-23a-3p與SIRT1之間的靶向關系，而SIRT1作為第一個被發(fā)現(xiàn)的sirtuins家族成員，可以通過非組蛋白去乙?；饔谜{節(jié)多種代謝過程，包括PGC-1α、胰島素受體底物2、PPARα、PPARγ、SREBP等進而調節(jié)胰島素分泌、脂肪生成和肌細胞生成。我們通過qPCR方法檢測了HFD誘導的miR-23a KO小鼠肝臟中脂代謝相關基因的表達，結果顯示Srebp1、Fas、Pparγ和Acc1顯著降低，Cpt1顯著升高，可能是因miR-23a KO后使SIRT1上調，進而影響了這些基因表達變化。同時，F(xiàn)OXO1轉錄因子在脂肪生成中具有重要作用，它在早期階段抑制脂肪細胞的分化［13］。有研究表明，SIRT1可以通過與FOXO1的多個賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；饔?，激活FOXO1表達進而增加脂聯(lián)素的分泌［14］。本研究的Western blot結果顯示，HFD誘導后miR-23a KO小鼠PPARα和p-AMPK/AMPK表達顯著增加，而Ac-FOXO1/FOXO1表達顯著降低，這一結果初步證實miR-23a可以通過調控SIRT1/FOXO1影響肝臟脂肪代謝。因此，下調miR-23a-3p可以降低HFD造成的肝臟脂質蓄積及血脂異常在內的代謝紊亂，緩解NAFLD小鼠肝臟的損傷情況。盡管我們的研究表明系統(tǒng)性敲除miR-23a-3p有效降低了HFD誘導下體重增長和脂肪蓄積，但這一現(xiàn)象需要在HFD誘導下才有顯著的表現(xiàn)。進一步證實miR-23a-3p在NAFLD中的直接作用，還需使用肝臟組織特異性敲除miR-23a-3p動物來進行后續(xù)深入的研究。同時miR-23a和miR-23b作為同一簇的miRNA，在發(fā)揮脂代謝調控作用時，相互之間的關系是怎樣的？后續(xù)需要利用miR-23a和miR-23b雙敲除小鼠予以驗證。

綜上所述，我們的研究證明miR-23a-3p在肝臟脂肪代謝中發(fā)揮一定的調控作用，miR-23a-3p的缺失可誘導SIRT1表達上調，進而通過去乙酰化作用激活FOXO1及下游相關因子，有助于緩解HFD誘導的肝臟脂肪蓄積，減輕肝臟炎癥和纖維化損傷。