王德秀，李建設(shè)，殷 月，高菁婕，王詠婧，蔡 欣△，王玉良△

（1濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；3濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東濰坊261053）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由于腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）等腦血管疾病引起的機體認(rèn)知功能障礙綜合征［1］。高齡、吸煙、飲酒、高血壓、高血脂等易誘發(fā)VD，VD患者表現(xiàn)為注意力不集中，認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力下降，對日常工作生活產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，臨床中對VD的發(fā)生進行早期診斷和干預(yù)治療是提高患者生存質(zhì)量，減輕家庭和社會負(fù)擔(dān)的重要措施。

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類具有自我更新能力和分化潛能的細胞［2］，近年來研究顯示，腦I/R后可引發(fā)NSCs增殖［3］，由于I/R后腦組織微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致NSCs的增殖能力有限，因此如何放大NSCs增殖，對抗腦組織結(jié)構(gòu)和功能損害成為目前研究的重點。

apelin受體APJ是G蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptors，GPCRs）家族成員之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達，能降低腦I/R導(dǎo)致的細胞凋亡、自噬、炎癥以及氧化應(yīng)激等反應(yīng)，具有重要的神經(jīng)保護作用［4］。大量研究表明GPCRs能形成二聚體，參與先兆子癇（血管緊張素Ⅱ1型受體和緩激肽受體B2二聚體）、抑郁癥（血清素1A受體和血清素7受體二聚體，甘丙肽受體1型、2型和血清素1A受體二聚體）、精神分裂癥（多巴胺D2受體異二聚體）等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。

本課題組前期研究表明，APJ能形成同源二聚體，且在VD大鼠中apelin-13能增加APJ同源二聚體的比例，改善VD大鼠的認(rèn)知功能［6］，但其發(fā)揮作用的機制尚不清楚。鑒于大鼠的大腦結(jié)構(gòu)和功能與人類的高度相似，以及大鼠海馬對I/R損傷的高度敏感性，大鼠在大量的腦血管疾病研究中廣泛應(yīng)用。本研究利用VD大鼠模型探究APJ單體及其同源二聚體對海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）內(nèi)源性NSCs增殖的影響，以期為VD發(fā)生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物8周齡清潔級雄性SD大鼠60只，體重230～280 g之間，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK（魯）20190003。

1.2 藥物和試劑兔抗caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體購自Abcam；兔抗巢蛋白（nestin）抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；apelin-13購自Phoenix Pharmahandel。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組與給藥前期研究顯示，apelin-13能增加APJ的表達，APJ的高表達促進APJ同源二聚體的表達上調(diào)，而APJ的跨膜區(qū)1（transmembrane domain 1，TM1）能阻斷APJ同源二聚體的形成［7］。因此，添加apelin-13和apelin-13+TM1分別作為APJ同源二聚體組和APJ單體組。將48只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、apelin-13（0.05 mg·kg-1·d-1）組和apelin-13（0.05 mg·kg-1·d-1）+TM1（0.4 mg·kg-1·d-1）組，每組12只。藥物組大鼠于造模后7 d通過側(cè)腦室給予不同的藥物處理，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水處理，每天注射1次，連續(xù)7 d。

2.2 VD模型的建立利用我們實驗室之前的方法［8］建立VD模型，隨機選取46只大鼠麻醉后固定，頸部消毒后手術(shù)分離雙側(cè)頸總動脈，腹腔注射硝普鈉溶液（2.5 mg/kg）同時對雙側(cè)頸總動脈夾閉再通兩次，時間均為10 min，妥善縫合后正常喂養(yǎng)7 d，其余14只大鼠作為假手術(shù)組，只分離雙側(cè)頸總動脈，不進行頸總動脈夾閉和硝普鈉注射。

2.3 Morris水迷宮實驗在預(yù)溫至37℃的水迷宮內(nèi)放置一隱藏于水中的平臺，實驗開始前1 d，將大鼠置于不含平臺的水池中，讓其自由游泳2 min熟悉環(huán)境。實驗時將大鼠在每象限分別置入水中，記錄大鼠逃逸潛伏期（escape latency，EL），大鼠若2 min未登上平臺，EL記為2 min并輔助其登上平臺，每天實驗1次，連續(xù)3 d。

2.4 側(cè)腦室注射導(dǎo)管的植入造模后7 d，將大鼠麻醉后固定于小動物腦定位儀上，定位側(cè)腦室位置（以前囟為坐標(biāo)原點，向后0.8 mm，向右1.6 mm，深度3.8 mm）植入5 mm長的注射套管，利用造牙樹脂妥善固定套管于顱骨，縫合切口并給予抗感染措施。

2.5 HE染色大鼠麻醉后分別用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，取腦后固定48 h，每組隨機選取6只大鼠的腦組織，切取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，先脫水透明再進行石蠟包埋，然后使用半自動切片機將其切成約5 μm厚度的切片。切片脫蠟入水后進行蘇木素染色2 min，染色結(jié)束后用蒸餾水沖洗，1%鹽酸乙醇溶液分化5 s，碳酸鋰飽和溶液返藍，沖洗后滴加水溶性伊紅染色液2 min，乙醇梯度脫水后二甲苯透明2次，每次10 min，中性樹膠封片后光鏡觀察各組海馬CA1區(qū)并拍照記錄、分析病理改變。

2.6 免疫熒光（immunofluorescence，IF）染色取方法2.5制備的大鼠切片每組6～7張，脫蠟入水，微波抗原修復(fù)后正常山羊血清封閉，將兔抗nestin抗體（1∶25）和鼠抗PCNA抗體（1∶200）混合4℃過夜孵育，0.01 mmol/L pH 7.45的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌3次，每次5 min，均勻混合滴加TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠Ⅱ抗（1∶100）和FITC標(biāo)記山羊抗兔Ⅱ抗（1∶100），37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，利用含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下拍照。

2.7 Western blot實驗大鼠麻醉后斷頭，于冰上取出海馬組織，快速剪碎后加入預(yù)先配制并預(yù)冷的含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液中，于冰上充分勻漿，4℃、13 700×g離心力下離心15 min后取一定量上清檢測蛋白濃度，將SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液加入其余上清液中，在95℃水浴中放置10 min得到變性蛋白，調(diào)齊蛋白濃度后以每孔50 μg蛋白質(zhì)量進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。在室溫的條件下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗nestin抗體（1∶1 000）、鼠抗PCNA抗體（1∶5 000）和兔抗caspase-3抗體（1∶1 000），4℃過夜，TBST洗滌3次，每次5 min，分別加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔（1∶2 000）和山羊抗鼠（1∶3 000）Ⅱ抗，室溫孵育1 h，再用含Tween-20的Tris緩沖液（Tris buffer soulution，TBS）洗滌3次，每次5 min，最后均勻滴加ECL發(fā)光液，利用化學(xué)發(fā)光儀拍照并分析灰度。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示計量資料，采用F檢驗進行多組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 APJ單體和同源二聚體改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

46只大鼠進行VD模型制備，術(shù)后存活率為87.0%，模型成功率為82.6%。VD模型建立后，各組大鼠分別給予不同藥物經(jīng)側(cè)腦室注射7 d后進行Morris水迷宮實驗，結(jié)果顯示，模型組大鼠EL較假手術(shù)組顯著延長（P＜0.01）；而apelin-13組和apelin-13+TM1組大鼠的EL較模型組均顯著縮短（P＜0.05），但仍長于假手術(shù)組（P＜0.05），見圖1。

2 APJ單體和同源二聚體減輕VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷

Figure 1.APJ monomer and its homodimer improved learning and memory ability in VD rats.The escape latency of rats measured by Morris water maze at 15 days after cerebral ischemia/reperfusion.Mean±SD.n=12.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs VD group.圖1 APJ單體和同源二聚體對VD大鼠認(rèn)知功能的影響

HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，VD模型組、apelin-13組和apelin-13+TM1組中大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元均出現(xiàn)不同程度的病理損傷，且可以顯著地觀察到模型組細胞排列不規(guī)則，細胞核發(fā)生固縮，錐體細胞帶出現(xiàn)斷裂，細胞數(shù)目顯著減少（P＜0.01）；而與VD模型組相比，apelin-13和apelin-13+TM1組中錐體神經(jīng)元損傷程度較輕，存活的神經(jīng)元數(shù)目較多（P＜0.01），排列較整齊，且apelin-13組錐體神經(jīng)元的存活數(shù)目多于apelin-13+TM1組（P＜0.01），但仍少于假手術(shù)組（P＜0.05），見圖2。

3 APJ單體和同源二聚體組大鼠海馬DG區(qū)存在增殖的內(nèi)源性NSCs

PCNA/nestin免疫熒光雙重標(biāo)記實驗結(jié)果顯示，VD模 型組，apelin-13組和apelin-13+TM1組大鼠 于腦I/R后14 d海馬DG區(qū)均出現(xiàn)PCNA+nestin+DAPI+細胞，見圖3。

4 APJ單體和同源二聚體降低VD大鼠海馬區(qū)cleaved caspase-3蛋白水平

Western blot實驗結(jié)果顯示，VD模型組大鼠海馬區(qū)cleaved caspase-3的水平較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），而apelin-13組 和apelin-13+TM1組cleaved caspase-3的水平均較模型組顯著降低（P＜0.01），但apelin-13+TM1組cleaved caspase-3水平顯著高于apelin-13組（P＜0.01），見圖4。

5 APJ單體和同源二聚體促進VD大鼠海馬區(qū)nestin和PCNA蛋白的表達

利用Western blot檢測各組大鼠海馬組織內(nèi)nestin和PCNA的表達，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，VD模型組、apelin-13組和apelin-13+TM1組大鼠海馬區(qū)nestin和PCNA的表達水平均顯著升高（P＜0.01），apelin-13組和apelin-13+TM1組的表達均較模型組增多（P＜0.01），且apelin-13組高于apelin-13+TM1組（P＜0.01），見圖5。

Figure 2.After APJ monomer and homodimer treatment，the injury degree of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area of VD rats decreased.Morphological structure of HE staining in neurons of hippocampal CA1 area of rats at 15 d after cerebral ischemia/reperfusion was shown.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.圖2 APJ單體和同源二聚體減輕VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷

討 論

VD作為僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆性疾病，隨著人口老齡化程度的不斷加劇，其發(fā)病率也逐年升高，目前尚無有效的治療手段。1992年Reynolds等［9］首次從成年小鼠紋狀體內(nèi)分離出內(nèi)源性NSCs，并在體外增殖及分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。近年來隨著研究的不斷深入，已有研究證明在成年哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬DG區(qū)的顆粒下區(qū)（subgranular zone，SGZ）存在NSCs，且這兩個區(qū)域內(nèi)的NSCs在一定條件下能夠發(fā)生增殖、遷移和分化［10］。由于內(nèi)源性NSCs來源清晰，無排異性及低污染性，因此成為當(dāng)下治療腦I/R類疾病的熱點。受制于內(nèi)源性NSCs增殖數(shù)量有限，尋找能夠促進內(nèi)源性NSCs增殖和神經(jīng)再生的方法及手段，對于修復(fù)腦組織結(jié)構(gòu)和功能損傷具有重要意義。

Figure 3.After APJ monomer and homodimer treatment，the proliferation of endogenous neural stem cells（NSCs）in hippocampal DG area of VD rats increased.Immunofluorescence staining results of PCNA，nestin and DAPI in hippocampal DG area of rats in each group at 15 d after cerebral ischemia/reperfusion were shown.The scale bar=200 μm.PCNA labeled proliferating cells with green nuclei；nestin labeled neurofilament protein with red cytoplasm；DAPI labeled blue nuclei；PCNA+nestin+DAPI+cells（yellow fluorescence）were proliferating NSCs.圖3 APJ單體和同源二聚體對VD大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)源性NSCs增殖的影響

Figure 4.APJ monomer and homodimer decreased the protein level of cleaved caspase-3 in the hippocampus of VD rats.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.圖4 APJ單體和同源二聚體對VD大鼠海馬區(qū)cleaved caspase-3蛋白水平的影響

Figure 5.APJ monomer and homodimer increased the protein levels of PCNA and nestin in hippocampus of VD rats by Western blot.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs VD group；△△P＜0.01 vs apelin-13 group.圖5 APJ單體和同源二聚體對VD大鼠海馬區(qū)PCNA和nestin蛋白表達水平的影響

GPCRs是已知的體內(nèi)最大的受體超家族，同時也是具有重要意義的藥物靶點，影響NSCs的增殖和分化，如多巴胺D1受體活性被抑制后能夠促進人NSCs的增殖并阻礙其分化［11］。研究顯示，GPCRs二聚體在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［12］，5-羥色胺1A受體與食欲素1型受體形成二聚體后參與抑郁的發(fā)生過程［13］，糖皮質(zhì)激素受體二聚體與小鼠的認(rèn)知功能有關(guān)［14］，在小膠質(zhì)細胞中，大麻素受體（cannabinoid receptors，CBRs）的大麻素1型受體（cannabinoid type 1 receptor，CB1R）和大麻素2型受體（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）可形成異源二聚體，有望成為阿爾茨海默病的治療靶點［15］。

本課題組前期研究表明，APJ能形成同源二聚體且具有與單體不同的功能［7］。本實驗的水迷宮檢測結(jié)果表明，APJ同源二聚體和單體均能改善VD大鼠的認(rèn)知功能，且APJ同源二聚體的效果優(yōu)于單體，這說明APJ同源二聚體比單體具有更強的神經(jīng)保護作用。海馬CA1區(qū)是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分之一［16］，海馬區(qū)的神經(jīng)元，特別是海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元對缺血和缺氧表現(xiàn)得非常敏感［17］，本研究HE染 色結(jié)果 表明，apelin-13和apelin-13+TM1能 顯著減輕腦I/R引起的錐體神經(jīng)元損傷，增加神經(jīng)元存活的數(shù)目。為了進一步驗證APJ單體和同源二聚體的保護作用，本實驗利用Western blot對cleaved caspase-3的表達進行檢測，結(jié)果也充分表明，APJ同源二聚體和單體均能降低VD大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的凋亡，且APJ同源二聚體組抗凋亡效果優(yōu)于單體組。

PCNA作為一種細胞核定位蛋白，在生理條件下僅在增殖細胞中合成和表達，并參與損傷DNA鏈的修復(fù)，是評價細胞增殖狀態(tài)和DNA修復(fù)的重要指標(biāo)［18］，nestin則為NSCs的特異性標(biāo)志物。基于此，本研究利用PCNA/nestin免疫熒光雙重標(biāo)記實驗觀察各組大鼠海馬DG區(qū)NSCs增殖情況，利用Western blot檢測各組大鼠海馬區(qū)nestin和PCNA的表達，結(jié)果表明，APJ單體和同源二聚體均能增加VD大鼠海馬區(qū)nestin和PCNA的表達，促進VD大鼠海馬DG區(qū)NSCs的增殖，放大腦I/R后的神經(jīng)再生，且APJ同源二聚體的促增殖能力強于單體。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK組成，MAPK信號通路介導(dǎo)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，并參與神經(jīng)元的生長和分化［19］。研究表明，apelin通過MAPK信號通路誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中細胞骨架和緊密連接蛋白的表達，促進人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增殖和遷移［20］，apelin也能夠經(jīng)MAPK信號通路介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細胞增殖［21］，由此我們推測APJ同源二聚體也能經(jīng)MAPK信號通路發(fā)揮作用。KRAB相關(guān)蛋白1（KRAB-associated protein 1，KAP1）參與調(diào)節(jié)胚胎干細胞周期，控制細胞增殖和凋亡［22］。KAP1的翻譯后修飾，包括磷酸化和泛素化，對于胚胎發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要。研究報道，磷酸化的KAP-1能與PCNA相互作用以恢復(fù)S期DNA復(fù)制后的異染色質(zhì)［23］，還能在DNA損傷后招募DNA修復(fù)相關(guān)因子，以促進DNA修復(fù)［24］。據(jù)此我們推測，APJ單體和同源二聚體可能是經(jīng)MAPK信號通路激活KAP1的磷酸化，增加PCNA的表達，參與DNA的損傷修復(fù)，同時促進VD大鼠海馬DG區(qū)NSCs的增殖從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，具體機制我們將進一步研究。

綜上所述，APJ同源二聚體和單體均能改善VD大鼠的認(rèn)知水平，延緩海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的凋亡，并且APJ同源二聚體的效果優(yōu)于單體，其機制可能與促進VD大鼠海馬DG區(qū)NSCs的增殖有關(guān)，具體機制我們將進一步探尋。