陳春雨，秦 學，馬智超，徐慶萍，彭 歡，周四桂△

（1廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院臨床藥學重點?？?，廣東 廣州 510699）

心臟的主要收縮細胞是心肌細胞，占據心臟質量的85%［1］。細胞凋亡是細胞在各種病理或者生理因素刺激下主動結束細胞生命的一種特殊自主而有序的死亡方式，又稱程序性死亡，對維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義［2］。心肌細胞凋亡是心臟代償期向失代償期轉變的重要原因，在失代償期，由于心肌細胞的不斷丟失，而心肌細胞增殖能力有限，心肌細胞丟失所造成的影響不能通過細胞的有效增殖來彌補，導致心肌收縮功能受損，心收縮力下降，最終引起心力衰竭［3］。

線粒體氧化磷酸化和糖酵解是心臟產生ATP供能的兩個主要途徑［4］。在病理性心肌重塑期間，心肌能量代謝主要方式由脂肪酸β氧化轉變?yōu)樘墙徒猓?］，從而維持心肌供能。短鏈?；o酶A脫氫酶（short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD）是脂肪酸β氧化的關鍵酶，在FAD的作用下可催化線粒體脂肪酸脫氫反應［5］。我們的前期研究顯示，SCAD在慢性心力衰竭、急性心肌梗死后心力衰竭、心肌細胞凋亡模型中表達均顯著下調［6-8］。SCAD重組腺病毒對心力衰竭大鼠具有保護作用［9］。黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）作為SCAD的潛在穩(wěn)定劑，能夠增加蛋白質的穩(wěn)定性［10］。FAD作為SCAD的輔助因子，不僅參與氧化還原過程，還參與核苷酸形成，tRNA甲基化以及蛋白質折疊［11］。我們的前期研究顯示，FAD能夠激活心臟SCAD表達，抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化［12］。然而，FAD是否能夠通過激活SCAD，從而抑制心肌細胞凋亡，尚不清楚。本項工作采用叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）構建心肌細胞凋亡模型，探究FAD對H9C2心肌細胞凋亡的影響。

材料和方法

1 實驗細胞

大鼠心肌細胞系H9C2購于上海生命科學研究院。

2 主要試劑

BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific；SCAD酶活性試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；多克隆兔抗Bcl-2、Bax、SCAD、cleaved caspase-3、pro-caspase-3和單克隆鼠抗GAPDH購于Proteintech；tBHP和FAD購于Sigma；ATP試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；游離脂肪酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 tBHP處理H9C2心肌細胞迅速取出低溫保存的大鼠H9C2心肌細胞，置于37℃水浴鍋快速搖晃使其融化，將細胞液吸至含有9 mL完全培養(yǎng)液的離心管中，重懸后離心棄上清，加入3 mL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，吹散細胞后轉移至培養(yǎng)皿培養(yǎng)。當細胞密度達到80%時，細胞饑餓處理24 h，加入不同濃度的tBHP處理相同的時間或加入相同濃度的tBHP處理不同時間，以研究tBHP誘導心肌細胞凋亡的量效和時效關系。

3.2 FAD預處理實驗分組為：對照（control，Con）組、tBHP組、FAD組和tBHP+FAD組。H9C2細胞傳代隔天后，FAD組和tBHP+FAD組吸走含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，PBS漂洗細胞后加入含有FAD（10 μmol/L）［12］的培養(yǎng)液，Con組和tBHP組同樣操作后加入等體積不含FBS的高糖DMEM，24 h后，tBHP組和tBHP+FAD組加入tBHP（200 μmol/L）溶液處理6 h。

3.3 心肌細胞活力測定用CCK-8法檢測細胞活力，按照每孔1×104個細胞濃度，將90 μL細胞懸液種植于96孔板中，設置空白組，細胞生長穩(wěn)定后給藥組給予相應的藥物，作用終止后吸去原有培養(yǎng)液，PBS漂洗2次后每孔加入10 μL CCK-8稀釋液，37℃孵育4 h后，于450 nm下測量吸光度（A）。

3.4 SCAD酶活性檢測各組細胞給予相應藥物處理后，加入RIPA裂解液后，收集心肌細胞并于冰上裂解15 min，離心后取少量上清液用BCA試劑盒在波長570 nm處檢測樣品A值，代入標準曲線計算細胞蛋白濃度。按照VReagentC∶VReagentD∶VReagentE∶VReagentF=78∶10∶5∶5的比例于遮光處配制反應體系，以每孔100 μL加入酶活性板，置于酶標儀孵育20 min后加入20 μL的樣品，于660 nm波長下檢測樣品A值，計算各組細胞SCAD酶活性。

3.5 細胞游離脂肪酸含量檢測參照文獻中的方法［13］，游離脂肪酸與銅離子結合形成的脂肪酸鹽溶于氯仿，其含量與銅離子含量成正比，通過檢測銅離子即可檢測游離脂肪酸含量。各組細胞給予相應的藥物處理，作用終止后收集心肌細胞，測定蛋白濃度。在波長440 nm下通過紫外分光光度計檢測細胞的A值。按照游離脂肪酸試劑盒說明書公式計算出各組別游離脂肪酸含量。

3.6 ATP含量檢測嚴格按照ATP檢測試劑盒說明書把ATP標準溶液稀釋成適當的濃度梯度，按照VATP檢測試劑∶VATP檢測試劑稀釋液=1∶9的比例配制工作液，于不透光的96孔板中每孔加入100 μL的工作液，室溫下放置3～5 min后加入20 μL的標準品或者樣品，用連續(xù)波長多功能酶標儀檢測標準品和樣品的RLU值，并制定標準曲線，把檢測到的樣品RLU值代入到標準曲線中，檢測細胞蛋白濃度，計算出各組細胞ATP含量。

3.7 流式細胞術檢測細胞凋亡利用熒光探針annexin V-FITC識別凋亡細胞外翻的磷脂酰絲氨酸，而PI拒染活細胞的實驗原理，檢測心肌細胞凋亡情況。各組細胞給予相應的藥物處理后用不含EDTA的胰酶消化收集H9C2心肌細胞，離心后倒掉上清液，用冷的PBS漂洗細胞以洗去殘余的胰酶，盡可能吸去PBS。加入400 μL annexin V結合液重懸細胞調整細胞濃度，轉移至流式管中，于流式管中加入5 μL annexin V-FITC染色液，混勻后冰上避光孵育15 min，再加入10 μL PI染色液，混勻后避光孵育5 min，上機檢測并統(tǒng)計心肌細胞凋亡百分比。

3.8 Western blot分析將H9C2細胞裂解收集于EP管中，離心后取部分上清用于檢測蛋白濃度。蛋白在100℃下煮5 min。配制12%和10%的SDSPAGE凝膠。上樣，按照濃縮膠70 V、30 min，分離膠120 V、90 min的條件電泳。電泳完后，將蛋白轉移到PVDF膜上，330 mA、38 min快速轉膜，配制5%的BSA溶液封閉PVDF膜1.5 h。封閉完后加入Ⅰ抗（SCAD抗體，1∶2 000；Bcl-2、pro-caspase-3和cleaved caspase-3抗體，1∶1 000；Bax抗體，1∶10 000；GAPDH抗體，1∶100 000），4℃孵育過夜。第二天將膜與Ⅱ抗室溫下孵育1 h。洗膜后與化學發(fā)光底物結合在化學發(fā)光成像儀下曝光顯影，檢測蛋白表達。

3.9 ROS檢測將H9C2細胞種植于6孔板，當細胞量達到80%加入相應的藥物。作用終止后吸去原有培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍后每孔加入濃度為10 μmol/L不含血清的DCFH-DA稀釋液，在避光條件下置于細胞孵育箱孵育20 min，于黑暗處用不含FBS的高糖DMEM漂洗細胞以洗去未能與細胞充分結合的探針染料，用熒光顯微鏡于激發(fā)波長488 nm下觀察熒光，并用ImageJ軟件統(tǒng)計熒光強度。

3.10 RT-qPCR檢測提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，選擇純度在1.8～2.0之間的樣品進行RTqPCR。采用逆轉錄PCR試劑盒去除gDNA后逆轉錄合成cDNA，凍存于-20℃。根據SYBR Green試劑盒配制反應體系，進行cDNA的擴增和檢測，詳細引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學處理

以上所得數據用SPSS 25.0進行統(tǒng)計和分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同濃度及作用時間的tBHP對H9C2心肌細胞活力的影響

如圖1A所示，經濃度分別為0、50、100、200、300和400 μmol/L的tBHP干預6 h，心肌細胞活力隨著tBHP濃度的增大而減小。如圖1B所示，心肌細胞在200 μmol/L的tBHP作用下，作用時間分別為0、1、4、6和8 h時，細胞活力隨著作用時間的增加而減小。tBHP濃度為200 μmol/L時干預心肌細胞6 h后，心肌細胞的活力降至50%左右，因此后續(xù)實驗采用tBHP濃度為200 μmol/L干預6 h的實驗條件進行研究。

2 不同濃度及作用時間的tBHP對H9C2心肌細胞SCAD蛋白和mRNA表達的影響

如圖2所示，Western blot結果顯示，心肌細胞在tBHP的干預下，SCAD蛋白表達隨著tBHP濃度的增高和作用時間的延長而降低。RT-qPCR結果與Western blot結果趨勢一致，tBHP濃度為200 μmol/L干預6 h時，SCAD mRNA的表達下降最為顯著。該結果亦支持200 μmol/L的tBHP干預6 h作為后續(xù)實驗條件。

3 FAD對H9C2心肌細胞SCAD表達水平的影響

0、0.1、1、10和20 μmol/L FAD預處理心肌細胞24 h后，tBHP作用6 h的條件下，與Con組相比，給予tBHP后，SCAD蛋白表達均顯著下降（P＜0.01）；與tBHP組相比，不同濃度的FAD作用下，SCAD蛋白表達隨著FAD濃度的增高而增加，在濃度為10 μmol/L時，SCAD蛋白表達增加最為顯著（P＜0.01），因此后續(xù)采用10 μmol/L作為FAD的實驗劑量，見圖3A。與Con組相比，tBHP誘導心肌細胞凋亡模型中SCAD的蛋白和mRNA表達顯著減少，SCAD酶活性顯著下降（P＜0.01），給予FAD干預后，SCAD的蛋白和mRNA表達顯著增加，SCAD酶活性顯著增強（P＜0.01），見圖3B～D。

4 FAD對H9C2心肌細胞凋亡率和活力的影響

與Con組比較，tBHP組心肌細胞大量凋亡，凋亡率顯著升高，給予FAD處理后心肌凋亡率顯著下降，見圖4A。與Con組比較，tBHP組心肌細胞活力顯著減弱（P＜0.01）；經FAD干預后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細胞活力顯著增強（P＜0.01），顯示出與細胞凋亡率相同的趨勢，見圖4B。

Figure 1.The effect of tBHP on the viability of H9C2 cardiomyocytes.A：the viability of H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP for 6 h；B：the viability of H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP（200 μmol/L）for different time periods.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group.圖1 tBHP對H9C2心肌細胞活力的影響

Figure 2.The effect of tBHP on the protein and mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes.A：the protein expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP；B：the protein expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP for different time periods；C：the mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of tBHP；D：the mRNA expression of SCAD in H9C2 cardiomyocytes treated with tBHP for different time periods.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group.圖2 tBHP對H9C2心肌細胞SCAD蛋白和mRNA表達的影響

Figure 3.The effect of FAD on SCAD protein and mRNA expression in H9C2 cardiomyocytes.A：the SCAD protein expression in H9C2 cardiomyocytes treated with different concentrations of FAD；B：the SCAD protein expression in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD；C：the SCAD mRNA expression in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD；D：SCAD enzyme activity in H9C2 cardiomyocytes treated with 10 μmol/L FAD.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs tBHP group.圖3 FAD對H9C2心肌細胞SCAD蛋白和mRNA表達的影響

5 FAD對H9C2心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

如圖5所示，與Con組相比，tBHP組心肌細胞促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達顯著增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比值顯著降低（P＜0.01）；經FAD干預，心肌細胞內cleaved caspase-3表達顯著減少（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著上升（P＜0.01）。

6 FAD對H9C2心肌細胞能量代謝的影響

與Con組相比，tBHP組心肌細胞ATP含量顯著減少（P＜0.01）；給予FAD干預后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細胞ATP含量顯著增加（P＜0.01），見圖6A。與Con組相比，tBHP組心肌細胞游離脂肪酸含量顯著增加（P＜0.01）；給予FAD干預后，與tBHP組相比，tBHP+FAD組心肌細胞離脂肪酸含量顯著減少（P＜0.01），見圖6B。

7 FAD對H9C2心肌細胞ROS含量的影響

如圖7所示，與Con組相比，tBHP組ROS含量顯著增加（P＜0.01），心肌細胞內氧化應激水平顯著增強；與tBHP組相比，經過FAD處理后，tBHP+FAD組心肌細胞內ROS含量顯著減少（P＜0.01），心肌細胞氧化應激水平顯著下降。

討 論

SCAD是脂肪酸β氧化的限速酶，也是黃素蛋白之一，在心肌能量代謝中發(fā)揮重要作用。FAD是電子轉移黃素蛋白泛醌氧化還原酶的輔助因子，構成了許多線粒體黃素蛋白脫氫酶的電子傳遞途徑，參與脂肪酸和氨基酸代謝。生理濃度下的FAD能夠顯著提高酰基輔酶A脫氫酶的穩(wěn)定性，FAD的結合對于黃素蛋白的催化活性以及正確的折疊、組裝和蛋白質穩(wěn)定性非常重要［14］，FAD結合位點的不穩(wěn)定性可能損害電子傳遞系統(tǒng)從而引起多?；o酶A脫氫酶缺乏癥［15］。

Figure 4.The effect of FAD on the apoptosis（A）and viability（B）of H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖4 FAD對H9C2心肌細胞凋亡率和細胞活力的影響

Figure 5.The effect of FAD on the expression of apoptosis-related proteins in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖5 FAD對H9C2心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

我們前期研究證明，SCAD表達下調與原代乳鼠心肌細胞凋亡密切相關，敲低SCAD基因的原代乳鼠心肌細胞，其凋亡程度顯著增加［8］。FAD可抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚和纖維化［12］；改善內皮細胞功能，保護內皮細胞免受tBHP誘導的損傷［16］。tBHP與H2O2性質相似，具有穩(wěn)定性高，不易降解的優(yōu)點，可誘導細胞體外凋亡［17］。因此，本研究進一步采用tBHP構建心肌細胞凋亡模型，探究FAD對tBHP誘導H9C2心肌細胞凋亡的影響及其可能的作用機制，為FAD用于臨床防治心肌細胞凋亡相關疾病提供實驗依據。

本研究中，在tBHP刺激下，H9C2心肌細胞凋亡率顯著增加，促凋亡蛋白表達增加，抗凋亡蛋白表達減少。經FAD干預后，H9C2心肌細胞凋亡情況緩解，促凋亡蛋白表達顯著減少，抗凋亡蛋白表達顯著增多，表明FAD對H9C2心肌細胞具有保護作用。tBHP誘導的H9C2心肌細胞，SCAD表達顯著下調；經FAD干預后，SCAD酶活性增加，蛋白和mRNA表達增多，H9C2心肌細胞凋亡率顯著下降，表明FAD可能通過增加SCAD表達，進而抑制H9C2心肌細胞凋亡。

Figure 6.The effect of FAD on energy metabolism in H9C2 cardiomyocytes.A：content of ATP in H9C2 cardiomyocytes；B：content of free fatty acid in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖6 FAD對H9C2心肌細胞能量代謝的影響

Figure 7.The effect of FAD on the content of ROS in H9C2 cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control（Con）group；##P＜0.01 vs tBHP group.圖7 FAD對H9C2心肌細胞ROS含量的影響

研究結果顯示，在tBHP刺激下，H9C2細胞ATP含量減少、游離脂肪酸含量增加，ROS蓄積增多，表明H9C2細胞出現了明顯的能量代謝障礙。給予FAD干預后，H9C2細胞ATP含量增加、游離脂肪酸含量減少，ROS蓄積減輕，表明FAD能顯著改善H9C2細胞能量代謝障礙。心肌細胞能量的70%來源于脂肪酸β氧化［18］。在tBHP刺激下，H9C2細胞SCAD表達下調，引起脂肪酸β氧化減少，ATP含量減少，游離脂肪酸含量增多。細胞內沉積的游離脂肪酸進入線粒體，破壞線粒體功能，損壞磷酸復合物，影響線粒體呼吸鏈的電子傳遞，導致ROS蓄積［19-21］。表明FAD可能通過增加H9C2細胞SCAD表達，促進脂肪酸β氧化，改善細胞能量代謝障礙，降低細胞內氧化應激水平，從而抑制細胞凋亡信號途徑。

我們前期研究證實，在分子動力學模擬中，與APO體系（無底物無FAD）相比，FAD-SCAD體系（無底物，有FAD）中SCAD蛋白結構的均方根偏差與回轉半徑值更低，原子波動幅度更小，二聚體的膨脹程度更低，具有更高的穩(wěn)定性和更緊密的分子結構［12］。此外，與FAD-SCAD體系相比，APO體系的底物口袋塌陷，而FAD的存在可防止底物口袋塌陷，有利于底物順利進入催化口袋完成催化反應。FAD對SCAD蛋白結構的緊密度以及催化口袋的穩(wěn)定至關重要，表明FAD是SCAD穩(wěn)定發(fā)揮催化反應的前提。因此，增加FAD在SCAD中結合位點的飽和度，可能是FAD促進脂肪酸β氧化，抑制心肌細胞凋亡的機制之一。

綜上所述，FAD可能通過結合SCAD口袋，穩(wěn)定其結構，提高SCAD酶活性，增加SCAD表達，促進脂肪酸β氧化，改善心肌細胞能量代謝，降低細胞內氧化應激水平，從而抑制心肌細胞凋亡。本研究從心肌細胞能量代謝視角闡明FAD在心肌細胞凋亡中的作用，為臨床上FAD用于防治心肌細胞凋亡相關疾病提供了實驗依據。然而，FAD通過激活SCAD抑制心肌細胞凋亡的分子機制，尚需深入研究。