尤揚(yáng)子，劉曉東，曲延英，趙 帥，帕熱哈·艾海提，雷建峰*

(1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

MADS-box基因在植物體內(nèi)是一個(gè)龐大的基因家族，在調(diào)控植物生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中發(fā)揮重要的作用。目前為止，MADS-box基因可分為Ⅰ和Ⅱ型兩大類[1]。Ⅰ型MADS-box基因只含有1～2個(gè)外顯子，編碼1個(gè)高度保守的SRF-like MADS結(jié)構(gòu)域，但沒有K結(jié)構(gòu)域。Ⅱ型MADS-box基因一般由6～8個(gè)外顯子組成，包含MEF2-like MADS結(jié)構(gòu)域、I結(jié)構(gòu)域、K結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域[2-3]。

MADS-box基因家族編碼的蛋白質(zhì)屬于轉(zhuǎn)錄因子，其N端保守的MADS結(jié)構(gòu)域可以特異性結(jié)合下游啟動子上的DNA順式元件調(diào)控靶基因的表達(dá)。AGL16(AGAMOUS-LIKE16)轉(zhuǎn)錄因子是Ⅱ型MADS-box基因家族成員之一，其mRNA主要在葉保衛(wèi)細(xì)胞和毛狀體中積累。研究表明，AGL16 mRNA的積累由miR824調(diào)控，超表達(dá)miR824或者使AGL16基因突變可以減少氣孔的數(shù)量，而抗miR824的AGL16轉(zhuǎn)基因植株增加了氣孔的發(fā)生率[4]。近期研究表明AGL16基因參與植物的抗旱反應(yīng)。該基因通過調(diào)控氣孔密度和ABA水平在響應(yīng)干旱脅迫的過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用[5]。在擬南芥中，agl16 T-DNA插入突變體較野生型失水率顯著降低，抗旱能力明顯增強(qiáng)，主要是由于AGL16基因發(fā)生移碼突變功能喪失后，葉片的氣孔數(shù)量減少、ABA含量更高，而AGL16超表達(dá)株系則表現(xiàn)出相反的表型[5]。同源比對分析發(fā)現(xiàn)，在很多農(nóng)作物中都存在與擬南芥AGL16高度同源的基因。這些農(nóng)作物中的同源基因是否具有與擬南芥AGL16基因相同的功能，需要進(jìn)一步驗(yàn)證，最快捷可靠的方式源自于這些同源基因是否能功能回補(bǔ)擬南芥agl16突變體的表型。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對植物特定基因組的遺傳改良[6-7]。sgRNA和Cas9蛋白是產(chǎn)生靶向突變的2個(gè)關(guān)鍵因素，當(dāng)二者一同轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在基因組目標(biāo)位點(diǎn)上切割雙鏈DNA斷裂，隨后生物體觸發(fā)自身DNA損傷修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生靶向突變，已有文獻(xiàn)報(bào)道，該系統(tǒng)還可以通過一次遺傳轉(zhuǎn)化事件同時(shí)敲除多個(gè)基因[8-9]，非常適用于基因家族功能的研究。本研究將利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向創(chuàng)制新的擬南芥agl16突變體，并對它的抗旱功能進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用AtU6-26∷sgRNA載體、棉花葉皺縮病毒CLCrV載體、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300、擬南芥Cas9超表達(dá)(Cas9-OE)植株均為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNAs載體構(gòu)建使用截短的AtU6-26(330 bp)啟動子驅(qū)動sgRNA表達(dá)。參照AGL16(At3g57230)基因組序列，利用CRISPR-GE在線軟件(http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/)設(shè)計(jì)了3個(gè)靶向敲除AtAGL16的sgRNA(表1)。靶序列合成參照雷建峰等[10]的方法，測序驗(yàn)證AtAGL16-sgRNA1、AtAGL16-sgRNA2和AtAGL16-sgRNA3表達(dá)載體是否正確。用SpeⅠ和PacⅠ酶切回收測序正確的AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1、AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA2和AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA3片段，將其分別重組到CLCrV-A載體上。對這些重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNAs質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，用于下一步接種。

1.2.2 擬南芥Cas9-OE 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及突變檢測擬南芥Cas9-OE種子經(jīng)消毒處理播種在1/2 MS培養(yǎng)基上，生長10 d左右后移栽至營養(yǎng)土中，待擬南芥長至7～8片蓮座葉時(shí)進(jìn)行接種轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將不同CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNAs農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注射到擬南芥Cas9-OE葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，具體操作參照雷建峰等[11]的方法。接種7～10 d后，分別從接種CLCrV-B和CLCrV-A衍生物的擬南芥葉片中提取基因組DNA。采用PCR/RE[12]的方法檢測3個(gè)AtAGL16基因靶位點(diǎn)是否發(fā)生突變，突變檢測引物設(shè)計(jì)見表1，選取可有效靶向敲除AtAGL16的sgRNA用于構(gòu)建完整的基因編輯載體。

表1 本研究中使用的引物序列

1.2.3 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建采用酶切連接的方法構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯載體，用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1載體，回收AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1片段(514 bp)，連接到35S∷Cas9-Ter-SK[13]載體上，構(gòu)建AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-SK載體。然后將核心元件AtAGL16-sgRNA1和Cas9重組到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，用HindⅢ和XbaⅠ酶切AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-SK載體，回收目標(biāo)片段(5 990 bp)，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，構(gòu)建AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-p1300載體(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，用于下一步擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建Fig.1 Construction of CRISPR/Cas9 vector

1.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及突變體篩選將構(gòu)建好的AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-p1300編輯載體，采用浸花法[14]轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，T0代種子播種在含有30 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗。以轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA為模板，野生型為對照，擴(kuò)增AtAGL16基因。反應(yīng)結(jié)束后對野生型和突變體的AtAGL16 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SacⅠ 酶切處理，對未被消化的PCR產(chǎn)物回收，連接到克隆載體上測序。最后，統(tǒng)計(jì)agl16突變植株在所有轉(zhuǎn)基因陽性植株中的突變效率。

1.2.5 擬南芥葉片氣孔密度觀察及失水率測定選取T3代agl16純合突變體植株，參照文獻(xiàn)[15]方法從野生型擬南芥和agl16純合突變體葉片背面獲取表皮細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察葉片氣孔密度并成像。從生長27 d且長勢一致的野生型擬南芥和agl16突變體植株上剪取大小相同的葉片，立即稱重，采用稱重法[16]比較野生型擬南芥和agl16突變體植株離體葉片失水率。在室溫下自然干燥，每隔1 h稱量鮮重測定失水率，設(shè)置10個(gè)重復(fù)。失水率計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[16]，最后用Excel 2019和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 抗旱表型鑒定及單株種子量測定對正常生長至27 d的野生型和agl16突變體幼苗進(jìn)行自然干旱以及干旱后復(fù)水處理，拍照記錄處理前后表型差異，并統(tǒng)計(jì)存活率。同時(shí)，選取未處理長勢一致的野生型和突變體植株測定單株收獲的種子量，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，檢測agl16突變體單株與野生型單株的種子量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥AtAGL16基因的靶向敲除

隨機(jī)選擇CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1、CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA2和CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA3擬南芥4～5株，采其葉片混樣，提取總DNA。以野生型擬南芥基因組DNA和混樣DNA為模板，通過PCR/RE的方法，檢測AtAGL16基因目標(biāo)位點(diǎn)的突變。對于AtAGL16-sgRNA1植株P(guān)CR擴(kuò)增AtAGL16基因(685 bp)，結(jié)果顯示：所有突變類型都為靶序列區(qū)域堿基的替換(圖2，A-C)。對于AtAGL16-sgRNA2植株擴(kuò)增AtAGL16基因(685 bp)，結(jié)果顯示：所有突變類型也均為PAM位點(diǎn)上游堿基的替換(圖2，D～E)。而對照野生型擬南芥中，上述2個(gè)靶點(diǎn)AtAGL16基因的PCR產(chǎn)物被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化完全，幾乎沒有擴(kuò)增產(chǎn)物殘留。與此同時(shí)，接種AtAGL16-sgRNA3的植株，擴(kuò)增AtAGL16基因(582 bp)，用靶位點(diǎn)ApoⅠ酶切PCR產(chǎn)物，沒有條帶殘留。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AtAGL16-sgRNA1和AtAGL16-sgRNA2可有效用于擬南芥AtAGL16基因的靶向敲除，本研究選取了突變類型相對較多的AtAGL16-sgRNA1用于后續(xù)研究。

M1～M7表示突變序列，S堿基替換用紅色大寫字母表示，S1表示堿基替換個(gè)數(shù)為1。A. AtAGL16-sgRNA靶向突變檢測(1. CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA2；WT. 對照；2. CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1；M. 2K PlusⅡDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量)；B. SacⅠ位點(diǎn)(突變)；C. M1～M7 表示AtAGL16突變測序；D. KpnⅠ位點(diǎn)(突變)；E. M1～M2 表示AtAGL16突變測序(PAM位點(diǎn)用綠色序列表示，藍(lán)色下劃線表示靶序列上的酶切位點(diǎn))圖2 CLCrV介導(dǎo)靶向敲除擬南芥AtAGL16基因M1-M7 indicates the mutation sequence, substitutions are denoted with red capital letters, S1 indicates that the number of base substitutions is 1. A. Detection of AtAGL16-sgRNA targeted mutations (1. CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA2; WT. Control; 2. CLCrV-AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1; M. 2K PlusⅡDNA marker); B. SacⅠsite (mutation); C. M1-M7 AtAGL16 mutation sequencing; D. KpnⅠsite (mutation); E. M1-M2 AtAGL16 mutation sequencing; Green color sequence indicates the PAM site, underline in blue indicates the restriction site on the target sequenceFig.2 CLCrV-mediated targeted knockout of Arabidopsis AtAGL16 gene

2.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

將靶向敲除AtAGL16基因的AtAGL16-sgRNA1與35S∷Cas9-Ter-SK載體連接，構(gòu)建sgRNA和Cas9雙元表達(dá)載體。然后將完整的核心表達(dá)元件重組到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，經(jīng)EcoRⅠ、XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定，酶切結(jié)果與預(yù)期酶切片段大小相符(AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1：514 bp，35S∷Cas9-Ter：5 476 bp，pCAMBIA1300：9 000 bp)，表明靶向敲除擬南芥AGL16基因的CRISPR/Cas9編輯載體構(gòu)建成功(圖3)。

1. AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-p1300載體；M. 2K PlusⅡDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量圖3 CRISPR/Cas9編輯載體的酶切鑒定1. AtU6-26∷AtAGL16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-p1300 vector; M. 2K PlusⅡDNA markerFig.3 Identification of CRISPR/Cas9 editing vector by restriction enzyme digestion

2.3 擬南芥agl16突變體檢測

潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因陽性苗，共獲得32株轉(zhuǎn)基因株系。對32株轉(zhuǎn)基因和野生型植株進(jìn)行突變檢測分析。結(jié)果顯示：野生型和未編輯植株的AtAGL16基因PCR產(chǎn)物經(jīng)SacⅠ酶切后產(chǎn)生521和164 bp 2條帶，幾乎沒有PCR產(chǎn)物殘留。而在被編輯的轉(zhuǎn)基因植株中AtAGL16基因突變發(fā)生在SacⅠ酶切位點(diǎn)處，導(dǎo)致SacⅠ無法識別和切割目標(biāo)DNA片段，仍然保留了685 bp的原始PCR片段(圖4，A)。選取部分植株沒有被SacⅠ消化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。結(jié)果表明，這些突變植株大多數(shù)為嵌合體，存在2種以上突變類型。其中，檢測到2株能產(chǎn)生移碼突變的突變體，1株在靶位點(diǎn)處缺失4個(gè)堿基，命名為AGL16:-4；另1株缺失1個(gè)堿基，命名為AGL16:-1(圖4，B、C)。此外在所有突變植株中并未檢測到agl16純合突變體，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)突變植株占所有轉(zhuǎn)基因植株的比例為37.5%(12/32)。

A. PCR/RE法檢測突變體(M. 2K PlusⅡDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量)；1～11. 轉(zhuǎn)基因株系(WT. 對照)；B. SacⅠ位點(diǎn)(突變)；C. 突變體AGL16:-4和AGL16:-1；PAM位點(diǎn)用綠色序列表示，藍(lán)色下劃線表示靶序列上的酶切位點(diǎn)。M1和M2表示突變序列，堿基缺失用紅色短線表示圖4 擬南芥agl16突變體檢測A. Detection of mutants by PCR/RE (M. 2K PlusⅡDNA marker); 1-11. Transgenic line (WT. Control); B. SacⅠsite (mutation); C. Mutants AGL16:-4 and AGL16:-1; Green color sequence indicates the PAM site, underline in blue indicates the restriction site on the target sequence. M1 and M2 indicate the mutation sequence, base deletions are indicated by red short linesFig.4 Detection of Arabidopsis agl16 mutants

2.4 擬南芥agl16突變體葉片氣孔密度觀察及失水率測定

氣孔由表皮兩種特殊的保衛(wèi)細(xì)胞組成，是調(diào)節(jié)外部環(huán)境CO2流入和水分流失的主要通道[17]。另外，失水率的大小是反映植株抗旱性的重要生理指標(biāo)[18]。本研究比較了野生型擬南芥和AGL16:-4純合突變體的氣孔密度，并測定了他們離體葉片的失水率。結(jié)果顯示：單位面積(mm2)AGL16:-4突變體的氣孔數(shù)量較野生型明顯減少(圖5，A)；AGL16:-4突變體失水率整體顯著低于野生型擬南芥，表型與擬南芥agl16 T-DNA插入純合突變體相似(圖5，B)。

圖5 擬南芥葉片氣孔密度觀察(A)和失水率測定(B)Fig.5 Observation of stomatal density (A) and determination of water loss rate (B) in Arabidopsis leaves

2.5 擬南芥agl16突變體耐旱表型鑒定

正常條件下，野生型擬南芥和AGL16:-4突變體植株長勢基本一致。干旱處理18 d后，大部分野生型植株因缺水逐漸干枯死亡，而突變體植株受脅迫的表型相對較輕。對這些植株進(jìn)行復(fù)水處理，存活率測定結(jié)果(圖6)顯示：野生型植株由于失水過度大部分已死亡，僅有少數(shù)植株存活，存活率為34.5%(10/29)。而突變體植株復(fù)水后大多數(shù)能正常生長，存活率為75%(27/36)。推測擬南芥agl16突變體可能通過減少氣孔密度，降低水分流失的方式來提高抗旱性。

圖6 擬南芥抗旱表型鑒定Fig.6 Identification of drought resistant phenotypes in Arabidopsis

2.6 擬南芥agl16突變體單株種子量測定

AGL16基因突變后沒有影響植株的正常生長發(fā)育，但并不代表其收獲的種子產(chǎn)量沒有發(fā)生改變。因此本研究對AGL16:-4突變體單株收獲的種子量進(jìn)行測定。結(jié)果(圖7)表明，AGL16:-4突變體植株單株收獲的種子量與野生型基本一致，無明顯差異。說明擬南芥AGL16基因突變后，其種子產(chǎn)量并沒有受到影響。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著圖7 擬南芥單株種子量測定Different normal letter indicates significant difference at the 0.05 levelFig.7 Determination of seed weight per plant in Arabidopsis

3 討 論

干旱是影響植物正常生長發(fā)育的脅迫因子，通過基因工程技術(shù)手段改善植物的耐旱性是目前世界范圍內(nèi)普遍采用的策略。通常情況下，植物體內(nèi)的抗旱正調(diào)控基因可通過超表達(dá)的方法加以驗(yàn)證。然而植物體內(nèi)還存在一些抗旱負(fù)調(diào)控基因，這些基因突變后抗旱性顯著增強(qiáng)。如：AtAGL16[5]、MdSE[19]、AtCOST1[20]、AtWRKY53[21]和OsWRKY5[22]等，并且一些突變體的生長發(fā)育與野生型相比并沒有明顯改變。那么這就需要相應(yīng)的技術(shù)手段破壞這些負(fù)調(diào)控基因的功能。RNAi技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)對靶基因mRNA的降解，但存在對目標(biāo)基因表達(dá)抑制不徹底、轉(zhuǎn)基因后代遺傳不穩(wěn)定的現(xiàn)象。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)具有突變效率高，遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)。目前已被廣泛應(yīng)用于一些農(nóng)作物功能基因組學(xué)的研究[23-27]。然而，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制遺傳變異突變體之前，必須要對sgRNA進(jìn)行篩選驗(yàn)證[28-29]。高效的sgRNA是獲得較高基因編輯效率的關(guān)鍵因素之一，植物病毒誘導(dǎo)的基因編輯(virus-induced genome editing，VIGE)是一種理想的快速驗(yàn)證sgRNA效率的技術(shù)體系[30-31]。該技術(shù)體系需要以Cas9-OE轉(zhuǎn)基因植株作為VIGE受體，將U6啟動子驅(qū)動的sgRNA組裝在植物病毒載體上，然后借助病毒可以在植物體內(nèi)系統(tǒng)擴(kuò)散的能力，誘導(dǎo)靶基因發(fā)生突變。因此，本研究首先設(shè)計(jì)了3個(gè)靶向敲除擬南芥AGL16基因的sgRNA，利用棉花葉皺縮病毒(CLCrV)介導(dǎo)的VIGE[32]系統(tǒng)在Cas9-OE擬南芥中測試，成功篩選到2個(gè)能定點(diǎn)編輯AGL16基因的sgRNA，這為創(chuàng)制擬南芥agl16突變體提供了良好的開端。

與野生型擬南芥相比，agl16 T-DNA插入突變體抗旱性顯著增強(qiáng)。為了簡單快捷地驗(yàn)證農(nóng)作物中與擬南芥AGL16同源基因的功能，本研究利用VIGE系統(tǒng)篩選出的AtAGL16-sgRNA1構(gòu)建完整的編輯載體來創(chuàng)制新的agl16突變體。對轉(zhuǎn)基因植株突變分析結(jié)果顯示，AGL16突變效率為37.5%，顯示出CRISPR系統(tǒng)的高效性和遺傳穩(wěn)定性。另外從部分發(fā)生突變的植株中篩選獲得了2株能夠產(chǎn)生移碼突變的agl16突變體，但由于AGL16:-1突變植株到T3代仍未檢測到純合體，本研究選取了AGL16:-4純合突變植株用于后續(xù)研究。AGL16:-4突變體單位面積氣孔密度、離體葉片失水率以及抗旱表型測定結(jié)果與agl16 T-DNA插入突變體測定結(jié)果相似[5]，說明本研究創(chuàng)制的擬南芥AGL16:-4突變體與agl16 T-DNA插入突變體具有相同的功能。若要AGL16基因用于作物分子抗旱育種，不僅要求其具有抗旱性，而且還需要突變植株收獲的種子量或者產(chǎn)量不減少。為此，本研究繼續(xù)測定了AGL16:-4突變體單株收獲的種子產(chǎn)量。結(jié)果表明AGL16:-4突變體植株單株收獲的種子量與野生型基本一致，無明顯差異。以上結(jié)果暗示著AGL16基因可作為作物抗旱育種理想的候選靶基因。

綜上所述，擬南芥AGL16:-4純合突變體的獲得，為后期從農(nóng)作物中克隆的AGL16同源基因進(jìn)行功能回補(bǔ)驗(yàn)證提供了有利的轉(zhuǎn)基因受體材料。