李晨陽，張學(xué)紅

蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是由子宮內(nèi)膜組織異位惡性侵襲其他臟器而引起的一系列病癥，易復(fù)發(fā)，不易根治，對(duì)患者的生殖健康帶來不同程度影響，嚴(yán)重者導(dǎo)致不孕［1］。由于EMS的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前臨床尚無有效且毒副作用小的治療手段［2］。卵巢是受子宮異位組織侵襲的主要器官之一［3-4］，據(jù)國內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（ovarian endometriosis，OEMs）占子宮內(nèi)膜異位癥的一半以上，嚴(yán)重影響卵巢功能［5］。

人參皂苷Rg3是人參的主要有效成分之一，具有抗血管生成、抗腫瘤等功效，能抑制癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)機(jī)體免疫力［6-7］。血管生成對(duì)于EMs病灶存活和生長有重要作用，利用人參皂苷Rg3抑制血管生成治療EMs的策略具有可行性。但是人參皂苷Rg3對(duì)OEMs血管生成的影響未見報(bào)道，因此本研究首次通過異位移植的方法建立OEMs大鼠模型，探索人參皂苷Rg3對(duì)OEMs血管生成相關(guān)因子的影響及其機(jī)制，為人參皂苷Rg3治療OEMs提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物60只健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（甘）2015-0005，適宜環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食攝水，適應(yīng)環(huán)境7天后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器人參皂苷Rg3（亞泰制藥，國藥準(zhǔn)字Z20030044，規(guī)格：10 mg/粒）；孕三烯酮（紫竹藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H19980020，規(guī)格：2.5 mg/粒）；戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥，國藥準(zhǔn)字J20171038，規(guī)格：1 mg/片）；RIPA裂解液（P0013B，Beyotime）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（P0010，Beyotime）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（P0018，Beyotime）；PVDF膜（HVHP29325，Merck Millipore）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（P0012A，Beyotime）；兔抗Akt1多克隆抗體（ab235958，Abcam）；兔抗p-Akt1單克隆抗體（ab81283，Abcam）；兔 抗ERK1/2多 克 隆 抗 體（ab17942，Abcam）；兔抗p-ERK1/2多克隆抗體（ab214362，Abcam）；兔 抗PI3K單 克 隆 抗 體（ab191606，Abcam）；兔 抗p-PI3K多 克 隆 抗 體（ab182651，Abcam）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（RR820L，Takara；Trizol（9109，Takara）；Prime-Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser，（RR047A，Takara）。HX202T型體重秤（天東衡器廠）；TP1020型組織脫水機(jī)（Leica）；KEDEE-KD-BMII型石蠟包埋機(jī)（上海科迪）；RM2245型石蠟切片機(jī)（Leica）；907型-80℃冰箱（Thermo）；IX73型顯微鏡（Olympus）；101-2A型烘箱（天津泰斯特）；Fisher Micro型4℃離心機(jī)（Thermo）；QL-901型渦旋混合器（其林貝爾）；J32392E型移液器（Eppendorf）；MCT-150-C型無酶EP管（Axygen）；BS-15-M型普通EP管（Biosharp）；188105W型載玻片（CITOTEST）；0677-1型蓋玻片（帆船）；0638型研缽；Nanodrop 2000型分光光度計(jì)（Thermo）；S1000型逆轉(zhuǎn)錄儀（BIO-RAD）；Mx3000p型熒光定量PCR儀（Aglient）；Myspin12型瞬時(shí)離心機(jī)（Thermo）；PCR-0208-C型0.2 mL八連管（Axygen）。

1.3 方法

1.3.1 分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、陽性藥物組及人參皂苷Rg3低、中、高劑量組。

1.3.2 大鼠OEMs模型的建立參考文獻(xiàn)［8］構(gòu)建模型方法，建模前2天選非發(fā)情期雌性SD大鼠，每只給予0.2 mg戊酸雌二醇。在無菌條件下，用3%異氟醚將大鼠麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上，腹部手術(shù)備皮，于腹部下方正中恥骨聯(lián)合上1 cm處縱行2～3 cm切口，開腹后找到子宮所在位置，剪下右側(cè)子宮，置于無菌生理鹽水中，剖開，分離子宮內(nèi)膜與肌層，剪取大小為5 mm×5 mm的子宮內(nèi)膜組織，并用可吸收線將其貼于左側(cè)卵巢并縫合，然后用青霉素和鏈霉素的稀釋液沖洗手術(shù)大鼠腹腔，常規(guī)縫合關(guān)腹。待大鼠蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察傷口恢復(fù)及生活情況。手術(shù)后第1天開始，大鼠肌肉注射16萬U/kg青霉素和鏈霉素，每日1次，連續(xù)注射3天。假手術(shù)組除不進(jìn)行子宮內(nèi)膜縫合在卵巢上，其余操作相同。

1.3.3 給藥第4天造模成功后各組大鼠灌胃給藥，陽性藥物組灌胃0.5 mg/（kg·d）孕三烯酮，人參皂苷Rg3低、中、高劑量組分別灌胃5、10、15 mg/（kg·d）人參皂苷Rg3。假手術(shù)組和模型組灌胃等劑量生理鹽水，每日1次，持續(xù)灌胃21天。

1.3.4 樣本采集 灌胃21天后，腹腔麻醉大鼠，在原切口處取出卵巢處的子宮內(nèi)膜移植物。參照FANG等［9］方法記錄移植物大體特點(diǎn)，電子天平稱取其質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其長、高、寬，計(jì)算體積：體積=0.52×長×寬×高。所取子宮與異位子宮組織部分液氮速凍，部分4%多聚甲醛固定。

1.3.5 蘇木精-伊紅（HE）染色取出4%多聚甲醛固定的子宮與異位子宮組織，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡拍照觀察組織病理變化，包括子宮內(nèi)膜上皮、腺體結(jié)構(gòu)，間質(zhì)細(xì)胞排列及炎癥細(xì)胞浸潤情況等。

1.3.6 免疫組化取出4%多聚甲醛固定的子宮與異位子宮組織，脫水、石蠟包埋，切片機(jī)切成4～5 μm厚的切片，貼于載玻片，依次脫蠟、水化、微波酸修復(fù)、阻斷內(nèi)源性氧化酶、封閉、孵育一抗過夜［其中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，Akt1）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，p-Akt1）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK1/2）抗體均以1∶200稀釋、洗滌、室溫孵育生物素標(biāo)記二抗、室溫孵育HRP標(biāo)記的鏈霉素，DAB顯色、拍照。

1.3.7 蛋白印記Western blot實(shí)驗(yàn)取出液氮保存的子宮與異位子宮組織，放于提前液氮冷卻的研缽中研磨，4℃條件下靜置30 min，4℃離心半徑13.5 cm，13000 rpm/min離心10 min，利用BCA試劑盒檢測(cè)上清中蛋白濃度后，取上清加入上樣緩沖液，加熱煮沸使蛋白變性，加入到SDS-PAGE膠中上樣，電泳分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、背景封閉；將一抗磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxykinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-hydroxykinase，p-PI3K）、Akt1、ERK1/2、p-ERK1/2均以1∶1000稀釋，p-Akt1抗體以1∶5000稀釋，稀釋后在4℃條件下孵育，洗脫后室溫條件下孵育二抗、顯色、顯影、定影等，并拍照分析數(shù)據(jù)。

1.3.8 定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）實(shí)驗(yàn)取液氮保存的子宮與異位子宮組織，置于提前用液氮冷凍的研缽中研磨后加入Trizol 1.5 mL研磨成勻漿，靜置5 min充分裂解后，4℃離心半徑13.5 cm，13000 rpm/min離心10 min，取上清液，加入等量氯仿，充分混勻后離心，所得上清加入預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，離心棄上清，所得白色沉淀用預(yù)冷的75%乙醇清洗干燥后向沉淀中加入DEPC處理水進(jìn)行溶解，-80℃冰箱保存。qPCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95℃，10 min；擴(kuò)增：95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，30 s；循環(huán)數(shù)為40。引物序列信息見表1。

表1 qPCR引物序列信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，方差不齊時(shí)用Dunnett's方法分析用比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮移植肉眼觀察大鼠OEMs模型，可見暗紅色或者透亮的囊泡，說明移植組織顯著變大，且部分大鼠子宮內(nèi)出現(xiàn)多房充滿液體的囊腫，移植組織表面有血管生成，可與周圍組織發(fā)生粘連，提示通過移植方法成功建立大鼠OEMs模型。見圖1。

圖1 大鼠OEMs模型

2.2 大鼠體質(zhì)量對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的增加緩慢穩(wěn)定增加；模型組大鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸降低，干預(yù)后異位子宮大鼠體質(zhì)量下降幅度減緩，并隨藥物濃度增加體質(zhì)量下降幅度減小。見圖2。

圖2 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.3 大鼠異位子宮體積及質(zhì)量模型組大鼠異位子宮體積與體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增加；與模型組相比，人參皂苷Rg3干預(yù)后，大鼠異位子宮體積與質(zhì)量均下降，并隨藥物干預(yù)濃度的增加，體積與質(zhì)量下降幅度越大。見表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜異位組織大?。ā纒）

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜異位組織大?。ā纒）

注：與模型組相比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；“-”表示無異位組織體積與質(zhì)量

組別對(duì)照組模型組假手術(shù)組陽性藥物組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3中劑量組人參皂苷Rg3高劑量組鼠數(shù)6 9 9 9 9 9 9劑量（mg/kg）等劑量生理鹽水等劑量生理鹽水等劑量生理鹽水0.5 5.00 10.00 15.00異位組織體積（mm3）-144.454±14.663-87.474±13.953**134.08±12.656 90.074±16.831*62.972±16.049**質(zhì)量（mg）-211.866±16.698-137.36±17.352**204.918±12.038 133.164±20.021**89.678±16.736**

2.4 異位子宮病理變化對(duì)照組子宮內(nèi)膜上皮結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，間質(zhì)細(xì)胞排列緊密，腺體結(jié)構(gòu)清晰。與對(duì)照組相比，假手術(shù)組子宮組織結(jié)構(gòu)無明顯變化；模型組異位子宮內(nèi)膜上皮組織破壞，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主。陽性藥物組及人參皂苷Rg3低、中、高劑量組隨著藥物濃度的增加異位子宮結(jié)構(gòu)趨于對(duì)照組，炎性細(xì)胞逐漸減少。見圖3。

圖3 各組大鼠子宮及異位子宮病理改變（×200）

2.5 子宮異位組織中VEGF、VEGFR-2、HIF-1α、MMP-9、MMP-2的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，假手術(shù)組異位子宮組織 中VEGF、VEGFR-2、HIF-1α、MMP-9、MMP-2的mRNA表達(dá)無變化，模型組以上各因子mRNA的表達(dá)均上升（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組各因子mRNA的表達(dá)均下降（P＜0.05），人參皂苷Rg3低、中、高劑量組各因子mRNA的表達(dá)隨濃度升高逐漸下降（P＜0.05）。見圖4—6。

圖4 子宮異位組織中血管生成相關(guān)因子mRNA表達(dá)

圖5 子宮異位組織中血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá)

圖6 子宮異位組織中血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá)柱狀圖

2.6 異位子宮組織中PI3K、p-PI3K、Akt1、p-Akt1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，假手術(shù)組各因子蛋白表達(dá)無變化，模型組p-PI3K、p-ERK1/2、p-AKT1表達(dá)均上升（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組p-PI3K、p-ERK1/2、p-Akt1表達(dá)均下降（P＜0.05），人參皂苷Rg3低、中、高劑量組p-ERK1/2、p-Akt1表達(dá)隨參皂苷Rg3濃度升高逐漸下降（P＜0.05），各組間PI3K、Akt1、ERK1/2總蛋白表達(dá)比較無明顯變化。見圖7—8，附圖1。

圖7 子宮內(nèi)膜異位組織中各因子蛋白表達(dá)

圖8 子宮內(nèi)膜異位組織中各因子蛋白表達(dá)柱狀圖

3 討論

子宮內(nèi)膜異位組織侵襲卵巢形成囊腫后影響卵巢功能，引起卵子質(zhì)量下降，從而患者生育能力降低［10］。而異位組織的種植生長需要充足的血液供應(yīng)，新血管形成是EMs發(fā)展的關(guān)鍵步驟［11］。因此，抑制血管生成、維持穩(wěn)定的血管平衡狀態(tài)成為臨床治療EMs的新方向。目前傳統(tǒng)EMs藥物治療方法是通過將機(jī)體的雌激素水平降至絕經(jīng)后水平，從而抑制異位病灶生長，使之萎縮，但會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重副作用如潮熱、體質(zhì)量增加、骨質(zhì)疏松、情緒易變等［12］。而抗血管生成藥物治療EMs具有特異性強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性，且復(fù)發(fā)率與副作用低等特點(diǎn)［13］。人參皂苷Rg3是從人參中分離提純的四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷單體，具有抗腫瘤血管生成作用，可通過降低腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶抑制細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)黏附、侵襲和血管生成；能阻斷纖維黏連層蛋白和層黏連蛋白的結(jié)合，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子、VEC的增殖生長和新生血管形成，阻斷細(xì)胞在血管壁著床，抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增長和血管生成。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3在體內(nèi)外可通過調(diào)節(jié)miRNA-27b降低EMs纖維化和侵襲［14］；通過抑制VEGFR-2介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR通路的激活抑制腹膜型EMs血管生成［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)通過異位移植的方式建立OEMs模型后，OEMs大鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸降低，給予人參皂苷Rg3干預(yù)OEMs大鼠，可減緩大鼠體質(zhì)量下降及其異位子宮的上皮組織結(jié)構(gòu)以及炎癥細(xì)胞的數(shù)量趨于正?；?，提示人參皂苷Rg3具有緩解OEMs病情的作用。

子宮內(nèi)膜異位組織移植理論認(rèn)為腹腔中出現(xiàn)脫落的子宮內(nèi)膜組織，是隨著經(jīng)血逆流而來，脫落組織經(jīng)“黏附-侵襲-血管形成”步驟移植于其他臟器［16］。而在經(jīng)期內(nèi)子宮內(nèi)膜處于缺氧狀態(tài)，脫落的內(nèi)膜組織進(jìn)入腹腔后持續(xù)處于缺氧狀態(tài)［17］，細(xì)胞為應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)因子HIF-1在各種細(xì)胞中均有表達(dá)，多項(xiàng)研究表明HIF-1α在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常內(nèi)膜組織［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)異位子宮組織中HIF-1αmRNA高于對(duì)照組和假手術(shù)組，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，HIF-1α在缺氧環(huán)境下的穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)異位內(nèi)膜組織的侵襲能力［20］，促進(jìn)了血管生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［21］，包括MMPs、VEGF等，其中VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，VEGF啟動(dòng)子區(qū)的HRE與HIF-1結(jié)合后激活轉(zhuǎn)錄，同時(shí)HIF-1α也可間接延長ERK活性，ERK的持續(xù)活化能夠促進(jìn)一系列血管生成因子表達(dá)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可濃度依賴性降低異位子宮組織中HIF-1α、VEGF、VEGFR、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)以及ERK1/2的磷酸化水平，提示人參皂苷Rg3可抑制異位子宮中血管生成相關(guān)因子表達(dá)，進(jìn)而通過抑制異位子宮血管生成抑制異位子宮生長。

研究顯示，信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR在促進(jìn)細(xì)胞增殖和新血管生成方面起關(guān)鍵作用，在PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt蛋白激酶起關(guān)鍵作用，通過磷酸化，達(dá)到最大活化效應(yīng)［23］。據(jù)Gordan等［24］研究，PI3K/Akt信號(hào)通路可促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而促使血管形成。CHANG等［25］報(bào)道內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中PI3K/Akt通路經(jīng)異常低表達(dá)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子（NME1）激活后，IL-8和VEGF大量表達(dá)，CD62E和CD105血管生成相關(guān)分子表達(dá)量增加，進(jìn)而促使異位病灶處生成大量血管內(nèi)皮細(xì)胞。研 究 發(fā) 現(xiàn)［26-27］內(nèi) 皮 型 一 氧 化 氮 合 酶（nitric oxide synthase，NOS）被Akt磷酸化后生成NO，進(jìn)而促進(jìn)血管生成，而EMs患者體內(nèi)eNOS表達(dá)升高［28］，異位病灶周圍血管生成增多，可能與PI3K/Akt通路激活相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可降低PI3K/Akt通 路PI3K、Akt的 磷 酸 化 水 平，對(duì)PI3K/Akt通路的激活具有抑制作用，進(jìn)而通過抑制PI3K/Akt通路控制的下游因子如HIF-1α、eNOS、VEGF、IL-8、CD62E和CD105等抑制異位子宮血管生成。但本研究只從已報(bào)道PI3K/Akt/mTOR通路與血管生成關(guān)系的角度推測(cè)人參皂苷Rg3可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路抑制EMs血管生成，但未在實(shí)驗(yàn)中直接證明該推測(cè)，因此本課題組將進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)直接驗(yàn)證這種推測(cè)。

綜上所述，人參皂苷Rg3可抑制OEMs中PI3K/Akt通路的激活，降低血管生成相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)和ERK1/ERK2的磷酸化水平，抑制OEMs血管生成。

附圖1子宮內(nèi)膜異位組織中Akt1、p-Akt1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)（×200）