郭凱凱，趙藝蔓，陳曉宇，凌慧，李洲強(qiáng)，郭東霖，張穎，侯恩存

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011

胃癌作為一種常見的惡性腫瘤，其致死率在全球所有惡性腫瘤中居第二位［1］。有研究表明胃癌的演變過程主要分為5個(gè)階段，分別是慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生、胃腺癌［2］。胃癌的治療方式包括手術(shù)、放療、化療等，雖然一定程度上能夠延長患者生命，但研究發(fā)現(xiàn)治療后患者會出現(xiàn)消化道出血、惡心嘔吐、厭食等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［3］。

胃癌屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“積聚”“癥瘕”等范疇［4］。《素問·遺篇·刺法論篇》載：“正氣存內(nèi)，邪不可干。”正氣虛弱是胃癌發(fā)生的主要因素，臟腑陰陽失衡為胃癌的形成提供了條件［5］。有研究表明化療的同時(shí)，配合中醫(yī)益氣扶正能有效緩解胃癌患者臨床癥狀，改善患者生活質(zhì)量，減輕化療毒副作用［6］。有研究表明人參、黃芪中的有效成分能抑制腫瘤增殖，加速胃癌細(xì)胞凋亡［7］。

本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，探討“黃芪-人參”藥物活性成分、潛在靶點(diǎn)以及作用機(jī)制，進(jìn)一步闡釋“黃芪-人參”藥對治療胃癌的作用機(jī)制及其新方法、新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人類基因數(shù)據(jù)庫（the human gene database，GeneCards，https：//www.genecards.org）、比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（http：//ctd.mdibl.org/）、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)平臺STRING v11.0（https：//string-db.org/）、生物信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.2.1軟件（http：//www.cytoscape.org/）。

1.2 “黃芪-人參”有效化合物及作用靶點(diǎn)獲取以TCMSP數(shù)據(jù)庫為依托，以黃芪、人參為檢索關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和藥物相似性（drug-likeness，DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）進(jìn)行篩選，獲取“黃芪-人參”藥對有效化合物及作用靶點(diǎn)。

1.3 胃癌相關(guān)靶點(diǎn)搜集利用GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫，以“Stomach Neoplasms”為檢索詞，檢索胃癌相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 “黃芪-人參”治療胃癌潛在靶點(diǎn)預(yù)測將藥物預(yù)測的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，生成藥物-化合物-靶點(diǎn)的藥理網(wǎng)絡(luò)圖，獲得“黃芪-人參”藥對治療胃癌的潛在靶點(diǎn)，并利用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interactions，PPI)構(gòu)建通過Cytoscape 3.2.1軟件Bisogenet插件構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。利用Cyto NCA插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO）及KEGG富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）將獲得的“黃芪-人參”治療胃癌的22個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入DAVID6.8中，以P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.01為篩選條件進(jìn)行富集分析，對富集分析結(jié)果按照P值由小到大排序，并使用Omic Share云平臺繪制成高級氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 “黃芪-人參”有效化合物和作用靶點(diǎn)在TCMSP平臺數(shù)據(jù)庫中，刪除重復(fù)后，“黃芪-人參”共有41個(gè)化合物，共篩出對應(yīng)的作用靶點(diǎn)384個(gè)。見表1。

表1 “黃芪-人參”藥對化合物信息

2.2 藥物成份-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將上述41個(gè)化合物與384個(gè)靶點(diǎn)以Excel文件格式分別定義數(shù)據(jù)和屬性文件，用Cytoscape 3.2.1軟件得到“黃芪-人參”成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選自由度（degree）靠前的靶點(diǎn)，藍(lán)色為顯著富集，黑色為非顯著富集。其中三角形代表藥物分子，圓形代表藥物作用靶點(diǎn)，共得到266個(gè)節(jié)點(diǎn)，645條邊。見圖1。

圖1 “黃芪-人參”成份-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 疾病靶點(diǎn)篩選通過GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫以疾病名稱進(jìn)行檢索，刪除重復(fù)項(xiàng)后，在GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫中共收集到473個(gè)疾病靶點(diǎn)，根據(jù)推理得分（Inference Score）篩選出前200個(gè)疾病靶點(diǎn)，以減少冗雜。

2.4 藥物及胃癌靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化及共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)將上述藥物依次上傳至靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫STRING進(jìn)行蛋白基因化，得到基因名。并通過Venny 2.1.0與胃癌靶點(diǎn)繪制蛋白韋恩圖，見圖2。成分與疾病共有靶點(diǎn)22個(gè)蛋白主要涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶1（serine/threonine protein kinase 1，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen activated protein kinase，MAPK8)、胱天蛋白酶3(Caspase-3，CASP3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTJS2）、胱天蛋白酶9（Caspase-9，CASP9）等。將交集靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.2.1軟件繪制得到聯(lián)系緊密的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖2 韋恩圖

圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析通過GO富集分析功能得出67個(gè)生物過程（biological process，BP），涉及血管平滑肌增殖、凋亡過程、對細(xì)胞因子的反應(yīng)等；8個(gè)分子功能(molecular function，MF)，涉及DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、染色質(zhì)結(jié)合等；6個(gè)細(xì)胞組成(cellular component，CC)，涉及原子核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等。見圖4—6。柱狀圖長度越長則富集基因數(shù)目越多、富集越顯著。

圖4 “黃芪-人參”有效作用靶點(diǎn)BP柱狀圖

圖5 “黃芪-人參”有效作用靶點(diǎn)MF柱狀圖

圖6 “黃芪-人參”有效作用靶點(diǎn)CC柱狀圖

通過KEGG通路富集分析得到65條通路，其共同靶點(diǎn)主要富集于病毒致癌、小細(xì)胞肺癌等疾病及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、TOll受體（TLR）信號通路、TNF等。泡泡節(jié)點(diǎn)越大則富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。見圖7—8。

圖7 黃芪-人參與胃癌有效作用靶點(diǎn)KEGG富集分析氣泡圖

圖8 KEGG信號通路

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，最終確定了“黃芪-人參”藥對中41個(gè)活性成分，384個(gè)作用靶點(diǎn)，篩選出“黃芪-人參”藥對中的5個(gè)主要有效成分，β-谷甾醇（betasitosterol）、槲 皮 素（quercetin）、山 奈 酚（kaempferol）等。孫玉成等［8］人體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-谷甾醇具有抗胃癌腫瘤細(xì)胞的作用，主要作用機(jī)制可能與下調(diào)P13K/AKT/m TOR信號通路蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬有關(guān)。有研究表明，β-谷甾醇能加速共刺激細(xì)胞增殖，進(jìn)一步增強(qiáng)對胃癌腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能與上調(diào)共刺激細(xì)胞中孔蛋白(pore-forming protein，PFP)等表達(dá)及活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信號通路相關(guān)［9］。耿威等［10］的研究表明，槲皮素能限制胃癌細(xì)胞繁殖和攻擊，可能與小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)表達(dá)有關(guān)。槲皮素能抑制胃癌MKN-45細(xì)胞，細(xì)胞的繁殖和增加，并且有可能進(jìn)一步加速其凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Caspase-3和Caspase-9活性相關(guān)［11］。山奈酚是多種植物的有效組成成分，具有顯著抗癌作用［12］。胃癌細(xì)胞內(nèi)CDK1/Cyclin B激酶復(fù)合物、下游G2/M周期相關(guān)蛋白的表達(dá)在山奈酚的調(diào)控下，能加速胃癌細(xì)胞凋亡［13］。

通過篩選發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK8、CASP3、CASP9、PTJS2、JUN等是“黃芪-人參”在對胃癌患者扶正過程中的主要靶點(diǎn)。在腫瘤細(xì)胞生長、繁殖、凋亡的生物過程中，AKT信號通路起一定調(diào)控作用，而AKT1信號通路能調(diào)控腫瘤細(xì)胞繁殖和凋亡，限制AKT1表達(dá)，緩解胃癌細(xì)胞的多種藥物耐藥性［14］。AKT信號通路主要作用之一是調(diào)控衰老細(xì)胞，AKT1的表達(dá)主要通過miR-30b限制，進(jìn)而干預(yù)干細(xì)胞的多能性、畸胎瘤的演變和增殖［15］。MAPK8信號通路和癌癥細(xì)胞的形成變化有一定關(guān)系，磷酸化腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)能使轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步惡化［16］。Mapk8基因是MAPK家族成員中重要的信號通路，其功能涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡的各個(gè)階段［17］。CASP3、CASP9可直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡，限制腫瘤細(xì)胞繁殖和生長［18］。研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中CASP3表達(dá)和腫瘤的臨床癥狀以及預(yù)后有關(guān)［19］。PTJS2是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，主要作用是促進(jìn)產(chǎn)生PGE2等炎癥介質(zhì)，進(jìn)而在“黃芪-人參”防治胃癌的過程中起擴(kuò)張血管作用［20］。C-jun是一種轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是促分裂原活化蛋白激酶信號通路的主要成員之一。

從GO分析結(jié)果可知，BP主要涉及血管平滑肌增殖、凋亡過程、對細(xì)胞因子反應(yīng)等。從KEGG富集分析可知，涉及的通路有TOll受體信號通路、TNF信號通路、NGF信號通路等信號通路。通路上含有的靶點(diǎn)越多，則通路發(fā)揮作用的可能就越大。TOll受體信號通路可通過TLR受體激動劑來調(diào)控TLR信號通路，從而提高機(jī)體對病原體的免疫力進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤的目的，同時(shí)還可通過TLR受體抑制劑調(diào)控TLR過表達(dá)以及TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終達(dá)到抑制腫瘤增殖和演變的目的［21］。TNF信號通路在機(jī)體內(nèi)外都能殺傷、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和形成，TNF-α對機(jī)體免疫調(diào)控主要是通過加強(qiáng)T細(xì)胞的表達(dá)而殺傷、抑制腫瘤細(xì)胞［22］。此外，富集與此信號通路上的JUN基因，作為重要的原癌基因，能調(diào)控細(xì)胞生長、分化，并且與多種腫瘤的形成有關(guān)。楊雪梅等［23］的研究表明，c-Jun mRNA、c-Jun的表達(dá)與炎癥因子TNF-α表達(dá)有顯著關(guān)聯(lián)性，主要通過限制巨噬細(xì)胞蛋白激酶信號通路上c-Jun表達(dá)而減少TNF-α釋放，進(jìn)而有效調(diào)控炎癥反應(yīng)和減輕內(nèi)毒素程度，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）可與靶細(xì)胞表面的NGF受體特異性結(jié)合而導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生，并調(diào)控神經(jīng)、血管及腫瘤等多種病理、生理過程，同時(shí)NGF還能作為絲裂原促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分裂、凋亡，在腫瘤形成與進(jìn)展過程中起重要作用［24］。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對“黃芪-人參”藥對治療胃癌的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，其可能通過抑制血管平滑肌增殖、凋亡過程、細(xì)胞因子應(yīng)答等過程治療胃癌并起扶正作用，但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身所具有的局限性以及忽略中藥成分含量等諸多因素，導(dǎo)致本研究獲得的結(jié)果可能存在一定偏差，有待臨床中的進(jìn)一步驗(yàn)證和證實(shí)。