夏偉，宋松林，廉維，王富猛，何玉友，董雅文

（吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林 吉林 132011）

PRV歸屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒屬(Varicellovirus)的豬皰疹病毒1型(Suid herpesvirus 1)，與其同屬的病原還有牛皰疹病毒1型和5型（BHV-1 and BHV-5）、禽傳染性喉氣管炎（ILTV）、馬皰疹病毒1型和4型（EHV-1 and EHV-4）、貓皰疹病毒1型、犬皰疹病毒1型以及綿羊皰疹病毒等。在電子顯微鏡下，PRV病毒粒子呈圓形或橢圓形外觀，含有囊膜的成熟病毒粒子直徑150～180 nm。PRV結(jié)構(gòu)的描述如下：與其他種屬的皰疹病毒類似，具有核酸和衣殼蛋白組成20面體對稱的核衣殼，圍繞核衣殼外層的蛋白皮層，囊膜位于病毒粒子的最外層，表面具有呈放射狀排列的纖突，PRV只有一個血清型，各分離毒株的毒力強弱不盡相同。PRV對外界環(huán)境的抵抗力要強于與其同屬的其他成員，在夏季PRV可以在外界環(huán)境中存活30d，冬季可以保持感染性長達(dá)46d。PRV在4℃條件下可以保存20周，病毒在-18～-35℃條件下效價下降較快，僅可保存12周；在液氮及真空冷凍干燥條件下，可以長期保持感染性；因此病毒培養(yǎng)物最好保存于-70℃以下或真空冷凍干燥條件下。脂溶劑可以使PRV滅活。PRV在低溫和常溫條件下比較穩(wěn)定，對高溫具有一定的抵抗力，在55℃～60℃可存活30～50min，70℃條件下可存活10～15min，80℃條件下3～5 min可將其滅活。PRV在pH4.0～12.0條件下比較穩(wěn)定，低溫條件下，在pH2.0和pH13.5的極端pH條件可以存活2～4h，高溫條件下病毒的存活時間會明顯縮短。

偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一種發(fā)熱、腦脊髓炎為主要臨床癥狀的急性傳染病。多呈局部暴發(fā)流行，成年豬主要表現(xiàn)為隱性感染，妊娠母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、弱仔和死胎，保育仔豬主要表現(xiàn)為呼吸道綜合征，而14日齡以內(nèi)的仔豬多以高死亡率為主要特征。處于病毒隱性感染的豬是極其危險的傳染源，病毒基因組可因應(yīng)激等因素重新活化成具有感染性病毒粒子。隨著豬偽狂犬病變異毒株的出現(xiàn)，PRV Bartha-K61弱毒活疫苗免疫失敗的現(xiàn)象頻頻發(fā)生，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。因此，針對PRV變異毒株的防控技術(shù)研究備受關(guān)注。豬偽狂犬病滅活疫苗是常用的預(yù)防豬偽狂犬病的主要手段之一，本研究主要以離子交換法純化高壓破碎的PRV細(xì)胞培養(yǎng)物滅活后制備滅活疫苗，免疫試驗豬，檢測中和抗體水平以驗證PRV變異毒株滅活疫苗的免疫原性，為科學(xué)防控PRV變異株對豬群的危害提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病毒液豬偽狂犬病病毒培養(yǎng)液，由吉林正業(yè)生物制品股份有限公司保存。

1.2 試驗動物5周齡健康仔豬15頭，經(jīng)檢測豬偽狂犬病毒核酸與抗體均為陰性，購自吉林某豬場。

1.3 填料型號Q-2填料，購自西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司。

2 方法

2.1 抗原純化將豬偽狂犬病病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，1000轉(zhuǎn)/min，離心10min，方法如下：

2.1.1 反應(yīng)條件整個純化過程在無菌的環(huán)境中進行。

2.1.2 緩沖液配制緩沖液A:20mmol/L PBS，pH7.0；緩沖液B:20mmol/L，PBS+1mol/L NaCl(電導(dǎo)87ms/cm)。

2.1.3 預(yù)裝柱根據(jù)說明書，將Q-2填料加入到500mL預(yù)裝柱中。

2.1.4 除雜和洗脫：Q-2流穿，Q-2洗雜，Q-2洗脫。

2.2 鑒定

2.2.1 純化前后病毒液效價測定將1000轉(zhuǎn)/min離心的豬偽狂犬病病毒原液、Q-2流穿，Q-2洗雜，Q-2洗脫分別進行病毒效價測定。

2.2.2 滅活檢驗取滅活24h后病毒液，按培養(yǎng)液10%、1%和0.1%（v/v）的比例同步接種于新消化的ST細(xì)胞懸液（2×105個/mL），分別接種6孔板，每個稀釋度設(shè)3孔，2mL/孔，置37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)120h，再連續(xù)盲傳2代，同時設(shè)正常細(xì)胞和病毒對照孔，然后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況。

2.2.3 免疫效果對比試驗（1）疫苗制備 將純化前后的病毒液毒價均調(diào)整到1×108.0TCID50/mL，滅活后分別與卡波姆佐劑按1:1（v/v）的比例混合，充分?jǐn)嚢柚瞥蓽缁钜呙纭?/p>

（2）分組 將15頭試驗豬隨機分為3組，每組5頭，其中兩組為免疫組，一組為對照組。

（3）免疫 用2.2.3疫苗制備中的2種疫苗分別頸部肌肉注射免疫組試驗豬，1mL/頭，免疫后3周以相同的劑量和方式加強免疫1次，對照組以相同劑量和方法注射生理鹽水。

（4）觀察 首次免疫后觀察14d，觀察試驗豬疫苗吸收情況、過敏情況，精神狀態(tài)和食欲等臨床癥狀。

（5）體溫測定 免疫后14d內(nèi)，每天測定各組試驗豬直腸體溫。

（6）抗體效價測定 加強免疫后2周，免疫組和對照組試驗豬一并采血，測定各組血清中和抗體效價。

3 結(jié)果

3.1 病毒含量測定檢測各階段的病毒液過濾產(chǎn)物的病毒含量，對1000轉(zhuǎn)/min離心后的病毒原液和Q-2流穿、Q-2洗雜和Q-2洗脫液的病毒效價測定結(jié)果表明，病毒原液毒價為1×108.5TCID50/mL、Q-2流穿病毒毒價為1×101.0TCID50/mL、Q-2洗雜病毒效價僅為1×101.5TCID50/mL，Q-2洗脫病毒效價達(dá)可達(dá)到1×108.0TCID50/mL（見表1）。

表1 純化各階段病毒液病毒含量測定

3.2 滅活檢驗取滅活24h后病毒液，按培養(yǎng)液10%、1%和0.1%（v/v）的比例同步接種于新消化的ST細(xì)胞懸液（2×105個/mL），分別接種6孔板，每個稀釋度設(shè)3孔，2mL/孔，置37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)120h，再連續(xù)盲傳2代，同時設(shè)正常細(xì)胞和病毒對照孔，滅活的病毒液均未出現(xiàn)病變情況（見表2）。

表2 滅活病毒育傳后的病變情況

3.3 臨床觀察將純化前后的病毒液利用1:2000的β-丙內(nèi)酯滅活后與卡波姆佐劑體積比1:1分別制備滅活疫苗，免疫試驗豬，免疫程序為首次頸部肌肉免疫1mL，間隔21d以相同的途徑和劑量進行二次免疫，臨床觀察表明，未純化處理的病毒液制備疫苗免疫試驗豬，其中1頭出現(xiàn)了厭食現(xiàn)象，而純化的病毒液免疫試驗豬未出現(xiàn)任何癥狀（見表3）。

表3 抗原純化前后疫苗免疫豬臨床觀察結(jié)果

3.4 體溫測定3批次疫苗免疫后14d內(nèi)，每天測定各組試驗豬直腸體溫，結(jié)果表明，免疫組試驗豬與對照組試驗豬相比體溫?zé)o明顯差異（見表4）。

表4 疫苗免疫豬后體溫測定結(jié)果

3.5 抗體效價測定（見表5）

表5 抗原純化前后疫苗免疫豬抗體水平比較

4 討論

自從我國出現(xiàn)了PRV變異毒株，PRV Bartha-K61活疫苗在臨床豬場免疫失敗的現(xiàn)象屢見不鮮，PRV變異毒株感染豬群后給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。因此，針對PRV變異株疫苗的研究迫在眉睫，PRV滅活疫苗是防控該病的主要手段之一，已有研究表明，PRV變異毒株滅活疫苗能夠給豬群提供免疫保護，制備一種安全高效的PRV變異毒株滅活苗作為防控和凈化PRV就顯得尤為重要。但是疫苗在臨床應(yīng)用過程中常常出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、四肢無力以及厭食等臨床反應(yīng)，嚴(yán)重者會出現(xiàn)豬死亡，副反應(yīng)對豬應(yīng)激大，易繼發(fā)其他疾病，嚴(yán)重影響豬群正常的生產(chǎn)性能。因此，在疫苗制備過程中去除雜蛋白和血清成分，能夠顯著降低疫苗對豬的副反應(yīng)，同時對于疫苗的均質(zhì)性和穩(wěn)定性也有顯著提高，疫苗保存時間會更長。本研究采用的離子交換法純化PRV，病毒液經(jīng)過Q2填料時，根據(jù)病毒和其他細(xì)胞和血清所帶電荷的不同，首先病毒被吸附到Q2填料上，其他雜蛋白未被吸附而流穿，然后將吸附到Q2填料上的病毒進行洗脫和除鹽，用于后續(xù)疫苗的制備，該方法比離心和過濾等方法更能有效去除雜蛋白。離心和過濾不能除掉血清成分和微小的細(xì)胞碎片。而該方法能夠有效去除疫苗半成品中的雜蛋白。本研究制備的純化PRV滅活疫苗接種試驗豬未見臨床過敏反應(yīng)，并且產(chǎn)生的中和抗體與未純化試驗組未見顯著差異，因此，隨著疫苗生產(chǎn)工藝不斷改進，病毒純化是疫苗生產(chǎn)工藝中一個非常重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已被我國動物生物制品企業(yè)高度重視，為做出世界一流的動物生物制品邁出了關(guān)鍵性一步。