羅，王詩惠，趙詩文，孫德啟，宋培剛，張賽賽，劉友林，宋新然，王偉★

（1.大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；3.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 大連 116023）

海象（Odobenus rosmarus）屬鰭腳目（Pinnipedia），海象科（Odobenidae），海象屬（Odobenus）。一般分布于北極和接近北極的海域。被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》和《瀕臨絕種野生動(dòng)植物國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅲ。海象在19世紀(jì)末和20世紀(jì)中期由于商業(yè)狩獵而嚴(yán)重枯竭。近年海象細(xì)菌性疾病的癥狀頻發(fā)，高溫季節(jié)尤為嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，創(chuàng)傷和微生物感染是導(dǎo)致死亡的主要原因。隨著全球氣候變化的威脅不斷增加，海冰棲息地的破壞再次威脅到海象的生存。有多個(gè)因素影響海象的細(xì)菌性疾病，如發(fā)育程度、局部創(chuàng)傷、維生素缺乏、環(huán)境和遺傳等。

我國豢養(yǎng)海獸種類豐富，在本土物種的基礎(chǔ)之上,從國外引進(jìn)了多種觀賞水生動(dòng)物,此外還有很多經(jīng)過選育、馴化、雜交的品種。隨著豢養(yǎng)種類的豐富，面臨的疾病危害也越發(fā)嚴(yán)重，尤其是細(xì)菌性疾病。在海象的易地保育過程中，面臨著嚴(yán)重的養(yǎng)殖病害，尤其是在預(yù)防與控制方面，需要從業(yè)人員進(jìn)一步加強(qiáng)，人工豢養(yǎng)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，病原和流行病學(xué)調(diào)查是非常有必要的。

本文旨在研究的易地保護(hù)和飼養(yǎng)過程中，海象常見的細(xì)菌性疾病主要集中在體表。近年來抗生素類藥物使用的逐步增加，致病菌對部分藥物的耐藥性也增加，因此尋求快速、有效的治療方案可以減輕海獸的痛苦，使其健康生活，并為海象等海洋哺乳動(dòng)物細(xì)菌性疾病的診治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料海象（來自大連圣亞海洋世界)。胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購于自天根生化科技(北京)有限公司）。引物（購于自生工生物工程股份有限公司）?？股厮幟艏埰ㄙ徲诤贾轂I和微生物試劑有限公司）。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)無菌條件下，使用胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）,設(shè)置三個(gè)平行培養(yǎng)基,以平板劃線法從患病海象體表分離細(xì)菌，28℃，培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌生長情況，取優(yōu)勢菌菌株HX1純化3次，于-80℃保存?zhèn)溆茫瑥囊鹊鞍纂舜蠖弓傊蛛x出優(yōu)勢菌，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察觀察培養(yǎng)24h后的菌落，對其大小、顏色等特征進(jìn)行測量。根據(jù)革蘭染色液說明書對優(yōu)勢菌HX1進(jìn)行染色并鏡檢。

1.3.2 16S rDNA基因序列測定使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取優(yōu)勢菌HX1的DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(正向引物F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；反向引物R:5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'對優(yōu)勢菌HX1的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5μL，dNTP(25 mmol/L)2μL，Taq DNA Polymerase0.15μL，模 板1μL，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，ddH2O 18.26μL。PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min 30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃下再延伸10min。

PCR產(chǎn)物由北京華大基因有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測定結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站用Blast軟件進(jìn)行同源性比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn)用0.9%無菌生理鹽水將培養(yǎng)36h的HX1制成終濃度為1.0×107CFU/mL的菌懸液，取100μL涂布于TSA培養(yǎng)基上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。將平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，記錄藥敏紙片周圍抑菌圈直徑。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)對藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離從患病海象體表分離得到一株優(yōu)勢菌落，將其命名為HX1，HX1在TSA培養(yǎng)基上生長緩慢，呈圓形，表面光滑。

2.2 病原菌的鑒定菌株HX1經(jīng)16S rDNA通用引物擴(kuò)增后得到的基因片段長度為1465bp，Blast分析結(jié)果表明，其與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)，相似度達(dá)100%。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示：氟苯尼考對菌株HX1較為敏感（見表1）。

表1 HX1菌對16種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 血液檢測在海象診治過程中，對患病海象血液指標(biāo)進(jìn)行了檢驗(yàn)。由此判斷海象機(jī)體狀況。根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定合適的治療方案。采取海象尾部靜脈血進(jìn)行檢驗(yàn)，血液檢測結(jié)果（見表2）。

表2 海象血液檢驗(yàn)結(jié)果

通過海象血液檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患病海象血液白細(xì)胞偏高,中性粒細(xì)胞比例增高,總蛋白高于正常值，這說明機(jī)體有細(xì)菌感染，并有輕微脫水癥狀。經(jīng)一段時(shí)間的診斷、治療之后，各項(xiàng)血液檢驗(yàn)指標(biāo)基本趨于正常。

2.5 治療根據(jù)患病海象的具體情況，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果,主要采取藥物治療。選取氟苯尼考給患病海象口服治療。治療期間加強(qiáng)對患病海象的日常飼養(yǎng)管理，包括餌料攝入、環(huán)境控制、常規(guī)體檢、用藥后反應(yīng)情況觀察等工作。

針對患病海象個(gè)體病況使用相應(yīng)藥物進(jìn)行治療（見表3）。同時(shí)在治療過程中，加強(qiáng)對患病動(dòng)物的日常護(hù)理工作，動(dòng)物病情逐步改善，現(xiàn)已痊愈。

表3 海象的治療方案

3 討論

在豢養(yǎng)海象過程中，有發(fā)生病變時(shí)，只進(jìn)行了宏觀檢查，這可能導(dǎo)致對細(xì)菌性疾病的診斷不足。本研究的一個(gè)局限性是樣本量過少，只針對發(fā)病個(gè)體進(jìn)行了診斷治療，未進(jìn)行對照試驗(yàn)和其它個(gè)體的臨床驗(yàn)證。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽孢和莢膜，廣泛分布于自然界的各種水環(huán)境中，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，也是水生動(dòng)物的條件致病菌?？梢痿~類、兩棲類及爬行類動(dòng)物暴發(fā)出血性敗血癥。本研究從患病海象體表分離出一株嗜水氣單胞菌，該菌在瓊脂平板上形成圓形凸起、表面光滑、灰白色的菌落。本研究基于對患病海象病因的分析診斷，結(jié)合海象臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌為主要的致病因子。近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌性和病毒性疾病頻發(fā)爆發(fā),嚴(yán)重影響水生生態(tài)穩(wěn)定以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。其中,嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌,能夠感染魚、蝦、蟹、貝等水生生物。

不同來源的嗜水氣單胞菌的理化特性具有一定差異，美洲紅源嗜水氣單胞菌與斑點(diǎn)叉尾源嗜水氣單胞菌均不分解阿拉伯糖，而團(tuán)頭魴源嗜水氣單胞菌與東北林蛙源嗜水氣單胞菌及本研究分離的鯉源嗜水氣單胞菌均能分解阿拉伯糖，因此，在生化鑒定基礎(chǔ)上通常還需進(jìn)行16S rRNA基因序列分析鑒定，以確保得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。不同分離源嗜水氣單胞菌對抗菌藥的敏感性常存在差異。

通過本研究藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考對從海象體表分離的嗜水氣單胞菌有較好的抑制作用。選用對致病菌敏感的氟苯尼考進(jìn)行治療，效果良好。細(xì)菌抗藥性的增加可能是近年來養(yǎng)殖業(yè)對抗生素的使用較為頻繁所致,因此研究和使用新的抗菌藥物治療對海象的細(xì)菌性疾病和進(jìn)行病害防治具有重要的意義。飼養(yǎng)環(huán)境中存在著一定數(shù)量的細(xì)菌,但不會對機(jī)體造成明顯危害，當(dāng)外界環(huán)境惡化或海象免疫力下降時(shí),細(xì)菌大量繁殖，可導(dǎo)致海象致病。

嗜水氣單胞菌是導(dǎo)致水生動(dòng)物細(xì)菌性敗血癥的主要病菌，因發(fā)病周期長、致死率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。再加上養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)雜性和不可控性，水生動(dòng)物疾病的發(fā)生與傳播，往往是多種因子綜合作用的結(jié)果，種間干擾等生物因素也可能會對嗜水氣單胞菌的致病力產(chǎn)生影響。嗜水氣單胞菌所攜帶毒力因子與其致病性緊密相關(guān)，都具有腸毒性、溶血性和細(xì)胞毒性，與動(dòng)物出血病、敗血癥有關(guān)，其致病過程為毒素單體與紅細(xì)胞膜表面特殊糖蛋白受體結(jié)合形成六聚體，聚合體插入細(xì)胞膜破壞其滲透屏障作用，使細(xì)胞破裂死亡，表現(xiàn)出血癥狀，與本研究中患病海象體表有出血點(diǎn)結(jié)果一致。

海象為水生哺乳動(dòng)物，在飼養(yǎng)過程中，水環(huán)境時(shí)刻影響著海象的健康，海象的體表細(xì)菌性疾病防控可以參考魚類，以預(yù)防為主，比如對各生態(tài)因子進(jìn)行有效的調(diào)控，應(yīng)用健康微生態(tài)制劑，做好調(diào)換水工作，使水環(huán)境達(dá)到最適合海象生存的條件。

患病海象口服氟苯尼考后，血液生化指標(biāo)變化明顯，這證實(shí)治療方案可行，針對目前海象種群資源稀缺，基于其高發(fā)的體表細(xì)菌性疾病，需要更高效快捷的診斷方法、治療方案和預(yù)防措施，本研究結(jié)果可為人工豢養(yǎng)條件下海象的健康養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)為海象的病害防控提供理論依據(jù)。