潘 鈺，夏海華，于 沖，曲曉軍，尹麗穎，葉 陽△

(1.黑龍江省科學院微生物研究所微生物藥物學中心，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江中醫(yī)藥大學實驗實訓中心，黑龍江 哈爾濱 150036)

衛(wèi)計委公布的《既是食品又是藥品的物品名單》中：葛根、姜黃、沙棘均有文獻報道具有護肝作用，他們均為藥食同源植物，他們的主要護肝作用成分分別為葛根素、姜黃素、沙棘黃酮或多糖[1-5]。三者可能通過不同的機制起到減輕肝損傷作用，葛根素能抑制甘油三酯合成，具有解酒護肝等功效作用[6]；姜黃素對肝臟疾病癥狀的預防和改善作用源于其抗氧化、抗炎癥作用，其護肝作用主要在于抑制肝纖維化[7]；抗氧化也是多種沙棘活性成分的重要特性，沙棘黃酮具有良好的自由基清除能力及抑制脂質(zhì)過氧化作用[8]。

本研究旨在通過建立CCl4小鼠肝損傷模型，將文獻報道過有護肝作用的“既是食品又是藥品”的葛根、姜黃、沙棘有效成分組成復方，探究復方對小鼠化學性肝損傷的輔助保護作用，以期為進一步開發(fā)對化學性肝損傷具有綜合作用的保健食品提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 葛根素，姜黃素，購自西安瑞林科技有限公司；沙棘黃酮，購自陜西冠晨生物科技有限公司；谷丙轉氨酶(AlanineTransaminase，ALT)、谷草轉氨酶(AspartateTransaminase，AST)、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(TotalCholesterol，TCHO)測定試劑盒，購自江蘇南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；四氯化碳(CarbonTetrachloride，CCl4)，購自中國天津富裕華工有限公司。

1.2 動物實驗 雄性昆明種小鼠(KM)，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。將小鼠養(yǎng)在動物室中，自由進食、飲水，給予標準顆粒飼料，控制溫度為20～22 ℃，相對濕度為55±10%，光照/黑暗循環(huán)為12 h。在適應一周后開始動物實驗。所有程序均符合實驗動物護理和使用指南。

稱重60只小鼠，隨機分為6組，即空白對照組(Control)，四氯化碳模型組(Model)，葛根素組(Puerarin，簡寫成Pue)、姜黃素組(Curcumin，簡寫成Cur)、沙棘黃酮組(Seabuckthornflavonoids，簡寫成Seaf)、復方組(葛根素、姜黃素和沙棘黃酮含量1∶1∶1，簡寫成Pue+Cur+Seaf)，葛根素組(Pue)，姜黃素組(Cur)，沙棘黃酮組(Seaf)各組中分別將各材料溶解在蒸餾水中，并使用圓頭喂食針口服給予小鼠。葛根素，姜黃素，沙棘黃酮組中的小鼠給藥劑量為300 mg/kg·d的相應材料，復方組中三種材料的劑量均為100 mg/kg·d(總量為300 mg/kg·d)，連續(xù)15 d，空白對照組和四氯化碳模型組中的小鼠接受等體積的蒸餾水。第15在d，急性肝損傷通過灌胃CCl4(0.4 mL，40%，溶于橄欖油)建立模型，空白對照組小鼠灌胃等量的橄欖油。禁食不禁水16 h后，稱重，用眼科鑷子摘取小鼠眼球采血，采用頸椎脫臼方法處死小鼠，剖開腹腔分離完整肝臟并稱重，計算肝臟/體重比率，即肝指數(shù)。小鼠血液靜置2 h后，通過離心(3000 rpm，10 min)獲得血清樣品，并在-80 ℃下儲存直至測定。收獲肝組織并將部分肝臟樣品固定在2.5%戊二醛溶液中用于組織學分析，將剩余的肝臟樣品立即浸入液氮中并儲存在-80 ℃直至使用。

1.3 血清酶分析 按試劑盒說明測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)含量。

1.4 肝臟指標測定 肝臟制備10%肝勻漿，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定勻漿液蛋白質(zhì)濃度，按試劑盒說明操作檢測小鼠肝組織中SOD的活性及MDA、GSH、TG和TCHO的含量。

1.5 組織病理學觀察 將小鼠肝臟切成0.5～1 mm3的小塊，將樣品塊浸入2.5%戊二醛溶液，制作超薄切片后用透射電鏡觀察各組肝臟切片。

2 結果

2.1 復方對CCl4急性肝損傷小鼠肝指數(shù)的影響 肝指數(shù)是一與肝臟損傷程度呈正相關的大體指標。與空白對照組相比，四氯化碳模型組小鼠肝指數(shù)顯著升高(P<0.05)。表明小鼠四氯化碳急性肝損傷模型造模成功。各組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠肝指數(shù)(P<0.05或P<0.01)；復方組和葛根素組、沙棘黃酮組比較，能更顯著降低肝指數(shù)(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

2.2 復方對CCl4急性肝損傷小鼠血清指標AST、ALT活性的影響 與空白組相比，四氯化碳模型組小鼠血清ALT、AST顯著升高(P<0.01)，表明小鼠四氯化碳急性肝損傷模型造模成功。葛根素組，姜黃素組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST(P<0.05或P<0.01)。沙棘黃酮組雖可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清AST(P<0.01)，降低ALT無顯著差異(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，復方能使小鼠血清中ALT、AST活性升高的趨勢下降，且與模型組比較差異有顯著性(P<0.01)(圖2)。

圖2 各組對CCl4急性肝損傷小鼠血清ALT(A)，AST(B)活性的影響

2.3 復方對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中MDA、SOD及GSH水平的影響 模型組小鼠肝勻漿MDA含量高于對照組，而SOD、GSH活性低于對照組(P<0.01)，表明本次實驗造模成功。葛根素組，姜黃素組、沙棘黃酮組和復方組小鼠肝勻漿MDA含量均低于模型組(葛根素、姜黃素、復方組P<0.01，沙棘黃酮組P<0.05)，復方組降低MDA含量的效果顯著優(yōu)于其他組；葛根素組，姜黃素組和復方組肝組織勻漿中SOD活性及GSH水平比模型組顯著升高(姜黃素、復方組P<0.01，葛根素組P<0.05)；沙棘黃酮組SOD活性與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，GSH水平較模型組顯著升高(P<0.05)；復方組提高SOD活性和GSH含量的能力相對較高(圖3)。

圖3.各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟MDA(A)，SOD(B)和GSH(C)活性的影響

2.4 復方對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中TG及TCHO含量的影響 與對照組相比，四氯化碳模型組小鼠肝臟中TG顯著升高(P<0.01)，葛根素組，沙棘黃酮組和復方組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠肝臟TG含量(P<0.05或P<0.01)。復方具有最顯著的效果，各組TCHO含量無顯著性差異(圖4)。

圖4 各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟TG(A)和TCHO(B)含量的影響

2.5 CCl4急性肝損傷小鼠肝組織病理學 透射電鏡掃描圖顯示空白對照組小鼠肝細胞細胞核完整，呈圓形，細胞中有少量脂滴；四氯化碳模型組小鼠肝細胞發(fā)生明顯核固縮，脂滴增多，線粒體變性；單一材料處理組選取了單獨作用護肝效果相對較好的姜黃素組，透射電鏡圖顯示姜黃素組小鼠肝細胞有較明顯的核固縮癥狀；復方組小鼠肝細胞脂滴明顯增多，細胞核基本完整，形狀不規(guī)則，顯示肝細胞受到輕微損傷(圖5)。

3 討論

四氯化碳進入肝臟后經(jīng)肝微粒體激活后產(chǎn)生了自由基，引起過氧化反應，使肝細胞受損，破壞膜結構，使脂質(zhì)內(nèi)ALT、AST進入血液，造成血清ALT、AST活性升高[9]；本研究中四氯化碳模型組小鼠血清ALT、AST含量較對照組顯著升高，葛根素組、姜黃素組和復方組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST，說明這幾種物質(zhì)能起到緩解肝損傷作用，同等含量下沙棘黃酮的護肝作用相對稍微弱些。同時掃描透射電鏡結果顯示四氯化碳模型組小鼠肝細胞出現(xiàn)核固縮，線粒體變性，脂滴增多，這些都是典型的受到損傷的肝臟細胞的特征；復方組透射電鏡結果顯示肝細胞損傷程度相對較輕，說明復方起到了一定的護肝作用。

氧化應激是通過活性氧(ROS)的產(chǎn)生和去除造成的一種不平衡的紊亂狀態(tài)。一方面，活性氧作為氧化代謝的副產(chǎn)物，經(jīng)常損傷細胞大分子，如DNA，脂類和蛋白質(zhì)[10]。ROS的爆發(fā)能夠造成脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)為MDA水平的升高。在本研究中，四氯化碳顯著增加了肝臟中MDA的含量，復方組明顯抑制MDA的產(chǎn)生，比葛根素、姜黃素、沙棘黃酮單獨作用效果顯著提升，復方可減輕肝細胞過氧化損傷。在本研究中，四氯化碳顯著降低了谷胱甘肽的含量，谷胱甘肽是參與細胞抗氧化防御的重要分子，還原型GSH通過清除一些過氧化物，與具有毒性的外來的親電子物質(zhì)相結合，從而維持細胞和細胞器結構的完整性[11]，同時也降低了抗氧化酶(SOD)的活性。復方組顯示具有較強的抗氧化作用，提高了谷胱甘肽濃度，增加了SOD酶活性。研究結果顯示，四氯化碳模型組與對照組相比，肝臟的TG值會顯著增高，表明四氯化碳明顯影響肝細胞脂肪代謝。而TCHO的含量并未出現(xiàn)顯著差異，推測是因為影響2種物質(zhì)代謝的原因不一樣，提示肝臟脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，復方組與模型組比較顯著降低TG含量，起到穩(wěn)定脂質(zhì)代謝作用。

復方組之所以護肝效果更好應該是多種組分之間相互協(xié)同作用的結果，中藥抗氧化應激和肝纖維化的作用機制特點為多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點，并涉及多種細胞因子及細胞內(nèi)信號分子網(wǎng)絡[12]。復方能更好的清除體內(nèi)活性氧自由基，清楚炎癥，阻止機體產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應，使得抗氧化酶SOD更好的發(fā)揮抗氧化作用。進而減少GSH的消耗，而且細胞內(nèi)GSH合成增多可以明顯抑制肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)的活化。

綜上所述，葛根素、姜黃素、沙棘黃酮組成的復方可以緩解四氯化碳引起的肝損傷，包括抑制脂質(zhì)積累和氧化應激。幾種有效成分物質(zhì)其他的比例是否有更好的護肝作用和其他潛在機制和信號通路有待進一步研究。