王 銳，王占黎，丁海濤，鄒 昊

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病相關(guān)生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

布魯氏菌屬是一種革蘭氏陰性、好氧、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)莢膜的桿菌，可引起布魯氏菌病[1]。布魯氏菌病是一種人畜共患的慢性傳染性疾病，給全球160多個(gè)國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)健康威脅和財(cái)務(wù)負(fù)擔(dān)[2]，每年全球約有50 000新增病例[3]。在中國(guó)，布魯氏菌病主要發(fā)生在北方地區(qū)，主要累及人群是青壯年農(nóng)牧民[4-5]。布魯氏菌有特殊的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，主要包括脂多糖、外膜蛋白和脂質(zhì)蛋白等[6]。其主要外膜蛋白(OMP)于1980年代初通過(guò)選擇性提取技術(shù)獲得[7]，根據(jù)其分子量分為三組，第一組蛋白分子質(zhì)量在94 kDa，第2組蛋白質(zhì)量在36～38kDa,同時(shí)被稱(chēng)為孔蛋白，第3組蛋白包括分子質(zhì)量27 kDa ，31～34 kDa和25～27 kDa。外膜蛋白對(duì)于維持膜的完整性和選擇性滲透至關(guān)重要，同時(shí)也是布魯氏菌重要的毒力因子，在布魯氏菌感染致病過(guò)程中起重要作用[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，布魯氏菌的外膜蛋白具有較好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力，可作為布魯氏菌病診斷性抗原和布魯氏菌亞單位疫苗的候選物[10]。

本文對(duì)目前幾種重要的布魯氏菌外膜蛋白相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步了解布魯氏菌外膜蛋白的特性，為研制布魯氏菌病的診斷試劑及相關(guān)疫苗提供參考價(jià)值。

1 OMP28

布魯氏菌外膜蛋白28(OMP28)，也稱(chēng)CP28或BP26，屬于第3組外膜蛋白，在流產(chǎn)布魯氏菌(B.abortus),豬布魯氏菌(B.suis),綿羊布魯氏菌(B.ovis),犬布魯氏菌(B.canis),沙林鼠布魯氏菌(B.neotomae)和馬耳他布魯氏菌(B.melitensis)中高度保守 ，是布魯氏菌病的重要診斷抗原[11]。它還可以有效誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，以預(yù)防布魯氏菌感染[12]。另外，OMP28可用于鑒別布魯氏菌自然感染動(dòng)物和疫苗免疫接種動(dòng)物[13]。Verstreate等[14]采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和生物膜層干涉(BLI)等方法分析了Bp26蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OMP28與I型膠原蛋白和玻連蛋白結(jié)合，也可與可溶性纖連蛋白結(jié)合，但不與層粘連蛋白結(jié)合。該研究還使用抗Bp26小鼠血清篩選Bp26抗原表位，發(fā)現(xiàn)5個(gè)線性表位，其中位于Bp26 C端的表位肽結(jié)合能力最強(qiáng)。這項(xiàng)研究有助于理解布魯氏菌與宿主靶細(xì)胞之間的相互作用，同時(shí)也有助于未來(lái)診斷、疫苗等的開(kāi)發(fā)研究。

Koyuncu等[15]克隆、表達(dá)和純化了布魯氏菌Omp28的前體Rev1，并基于ELISA技術(shù)開(kāi)發(fā)診斷試劑，其靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均較高，有望用于開(kāi)發(fā)人類(lèi)布魯氏菌病診斷試劑盒。另外，將重組外膜蛋白28(rOmp28)直接包被微量滴定板，采用間接ELISA進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，其靈敏度和特異性表現(xiàn)良好，證實(shí)了該重組蛋白質(zhì)是開(kāi)發(fā)布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷試劑的合適候選蛋白[16]。

近十年的研究表明，多組分疫苗比單組分亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)更多的保護(hù)性反應(yīng)[17]。來(lái)自不同布魯氏菌抗原的表位嵌合蛋白所組合成的疫苗，可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)布魯氏菌感染更有效的免疫應(yīng)答。有報(bào)道從Omp31，OMP28，BLS，DnaK和L7-L12蛋白中選擇了5個(gè)新的T細(xì)胞表位，采用生物信息學(xué)技術(shù)模擬設(shè)計(jì)了一種新型多表位疫苗，用以引發(fā)對(duì)布魯氏菌病的理想免疫反應(yīng),結(jié)果表明預(yù)防和治療布魯氏菌病的理想方法是設(shè)計(jì)靶向多種蛋白的多抗原表位肽，該疫苗被認(rèn)為是有潛力的[18]。基于生物信息技術(shù)模擬并且評(píng)估了該蛋白疫苗的免疫和理化特性，該項(xiàng)技術(shù)是一種簡(jiǎn)便高效的方法。

與固定的外膜蛋白相比，OMP28具有易于檢測(cè)的優(yōu)勢(shì), 是感染牲畜和人類(lèi)的一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，作為診斷抗原，準(zhǔn)確率> 90 %[19]。在動(dòng)物中使用減毒活疫苗免疫后，血清樣品顯示OMP28引起的應(yīng)答比強(qiáng)毒株弱很多[20]，作為潛在的疫苗靶標(biāo)有很大的可能性，值得進(jìn)一步研究。

2 OMP2b

布魯氏菌的Omp2b屬于第二組外膜蛋白，并且暴露在細(xì)胞表面[21]，是重要的36 kD孔蛋白。Omp2b在外膜蛋白中形成三聚體可參與營(yíng)養(yǎng)的吸收[22]。在布魯氏菌表面蛋白抗原中，Omp2a和Omp2b同時(shí)也被叫作孔蛋白，在經(jīng)典布魯氏菌種中顯示出最高的多樣性。編碼這些蛋白質(zhì)的基因在布魯氏菌基因組中緊密相連，方向相反。根據(jù)布魯氏菌屬的種類(lèi)，生物變種或基因型共有85 %～100 %的序列同源性[23]。golshani等[24]分析蛋白質(zhì)的物理化學(xué)參數(shù)，指出Omp2b是一種酸性(pH，4.53)且穩(wěn)定的親水性蛋白,其二級(jí)結(jié)構(gòu)是由7個(gè)α螺旋組成，該蛋白質(zhì)具有正確的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且在相同大小的天然蛋白質(zhì)范圍內(nèi)。

關(guān)于Omp2b作為診斷試劑研究的相關(guān)報(bào)道，Vatankhah等[25]基于重組Omp2b抗原，采用ELISA技術(shù)開(kāi)發(fā)診斷試劑，檢測(cè)了布魯氏菌陰性和接種其他革蘭氏陰性菌的小鼠血清，結(jié)果其特異性良好。他們后續(xù)的研究評(píng)估了從不同地區(qū)收集的牛血清以及已知的陰性和已知陽(yáng)性的血清樣品，發(fā)現(xiàn)Omp2b可以區(qū)分布魯氏菌感染的動(dòng)物和未感染的動(dòng)物，其靈敏度為88.5 %，特異性為100 %，準(zhǔn)確度為90.8 %。建議重組Omp2b可以作為一種蛋白抗原用于診斷國(guó)內(nèi)布魯氏菌病動(dòng)物，同時(shí)可以進(jìn)一步評(píng)估檢測(cè)人類(lèi)布魯氏菌病。

Omp2b具有高度免疫原性，其序列高度保守，可誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是設(shè)計(jì)新亞單位疫苗的優(yōu)先抗原[24]。Omp2b可刺激誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素γ和IL-4水平顯著增加[26]。近年來(lái)有研究[27]OMP2b和BCSP31組合的多表位免疫學(xué)疫苗，經(jīng)生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析表明OMP2b和BCSP31蛋白的2個(gè)T-B結(jié)合表位具有免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，激活體液免疫反應(yīng)并促進(jìn)穿孔素和顆粒酶B的產(chǎn)生，這些表位可用為布魯氏菌病的候選疫苗。也有研究[28]使用多種生物信息學(xué)軟件來(lái)分析Omp2b、p39和BLS的理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)，并預(yù)測(cè)其T和B細(xì)胞的主要表位，結(jié)果顯示Omp2b有3個(gè)線性B細(xì)胞顯性表位，5個(gè)CD8+ T細(xì)胞顯性表位和3個(gè)CD4 + T細(xì)胞顯性表位，這些表位是理想候選亞單位疫苗的優(yōu)勢(shì)選擇，同時(shí)表位預(yù)測(cè)可以為構(gòu)建理想的針對(duì)布魯氏菌病多價(jià)表位疫苗提供理論依據(jù)。

基于OMP2b免疫優(yōu)勢(shì)抗原所設(shè)計(jì)的新型疫苗制劑，與生物信息學(xué)工具所預(yù)測(cè)的抗原決定簇相輔相成，該項(xiàng)技術(shù)無(wú)需繁瑣、耗時(shí)的步驟即可對(duì)病原體完整的抗原進(jìn)行評(píng)估分析,這是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，值得進(jìn)行進(jìn)一步探索。

3 OMP19

根據(jù)發(fā)布的數(shù)據(jù)，OMP19是一種免疫反應(yīng)性外膜脂蛋白[29]，而且是最早在大腸桿菌中克隆、表達(dá)的布魯氏菌外膜蛋白[30]。這些重組蛋白也正在接受評(píng)估，以期有望用于生產(chǎn)新型疫苗，并在診斷方面有所突破[31-32]，其在血清學(xué)診斷方面的潛力也在積極探索。有報(bào)道利用克隆、合成并且純化好的OMP19，采用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌病，其檢測(cè)抗體的敏感性很高，但特異性中等[33]。Bulashev 等[34]采用重組布魯氏菌外膜蛋白19、25和31為診斷抗原，收集Omp19免疫的小鼠和兔子血清樣品，以及由實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和自然感染布魯氏菌病的151頭牛、12頭未接種疫苗的小母牛等血清樣本，檢測(cè)重組布魯氏菌Omp19、Omp25和Omp31的抗原性,結(jié)果表明布魯氏菌Omp19與Omp25和Omp31的結(jié)合可被用作針對(duì)未接種牛血清學(xué)檢測(cè)的靶抗原。

目前，OMP19在疫苗領(lǐng)域的研究報(bào)道較多，其可分為脂化型外膜蛋白19(L-OMP19)與非脂化型外膜蛋白(U-Omp19),U-Omp19被認(rèn)為是創(chuàng)建新型疫苗制劑最有希望的成分之一[35]。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被認(rèn)為是抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體(如布魯氏菌)必不可少的因素[36]。用表達(dá)四種布魯氏菌(BLS、PrpA、Omp19和SOD)蛋白的組合疫苗,鼠傷寒沙門(mén)氏菌作為載體遞送，可使組合疫苗的免疫原性有效保留，表明其在保護(hù)牲畜免受布魯氏菌侵襲方面具有潛在的用途[37]。有關(guān)腸上皮細(xì)胞對(duì)抗原的捕獲和加工能力的研究對(duì)于開(kāi)發(fā)新的口服給藥系統(tǒng)非常重要，高效的口服抗原輸送系統(tǒng)必須抵抗胃和腸道蛋白酶降解作用，充分有效地輸送抗原。已經(jīng)證明U-Omp19是一種具有自佐劑能力的蛋白[38]，其可通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)內(nèi)部的溶酶體蛋白酶抑制抗原的消化，從而延長(zhǎng)抗原的半衰期，增強(qiáng)抗原向T細(xì)胞的呈遞[39]，并促進(jìn)黏膜和全身性抗原特異性免疫應(yīng)答。細(xì)菌蛋白酶抑制劑U-Omp19可以與上皮屏障相互作用[40]，抑制腸細(xì)胞(刷狀邊界和細(xì)胞內(nèi)蛋白酶)對(duì)抗原蛋白水解的敏感性，但不會(huì)改變腸細(xì)胞的完整性和上皮屏障的通透性。U-Omp19可抑制胃腸道主要蛋白酶的作用，從而保護(hù)口服疫苗在傳遞過(guò)程中抗原免受消化，同時(shí)還可增加免疫反應(yīng)[41]。因此，被提議作為亞單位疫苗制劑的候選成分。

對(duì)于OMP19蛋白用于診斷的研究，眾多研究結(jié)果說(shuō)法不一，還需進(jìn)一步探索。亞單位疫苗，例如重組蛋白，是潛在的疫苗候選者，因?yàn)槠錈o(wú)毒、更安全、經(jīng)濟(jì)、純度高，利于批量生產(chǎn)。OMP19有潛在的疫苗研究?jī)r(jià)值，但還需要深入研究。

4 其他外膜蛋白

研究人員對(duì)OMP10、OMP16、OMP25等外膜蛋白在體外進(jìn)行原核表達(dá)，并基于ELISA技術(shù)作為診斷性抗原，系統(tǒng)分析了這些蛋白在診斷人類(lèi)、牛和山羊布魯氏菌病血清診斷中的作用[42]。結(jié)果表明，Omp16與嗜肺軍團(tuán)菌、沙門(mén)氏菌和副溶血性弧菌有交叉反應(yīng)性，Omp16、Omp25、Omp10 在診斷人類(lèi)布魯氏菌病的準(zhǔn)確度分別為93.49 %、88.76 %和93.49 %，診斷牛的準(zhǔn)確度分別為78.47 %、74.31 %和75.69 %，診斷山羊的準(zhǔn)確度分別為83.33 %、85.00 %和80.00 %。Omp16-IL2融合蛋白的重組乳球菌作為口服乳球菌疫苗，為評(píng)價(jià)成本效益、更安全、簡(jiǎn)單的藥品試點(diǎn)生產(chǎn)提供了一種有吸引力的新方法，也為其他異源蛋白抗原提供可行的傳遞模式[43]。與其他常用的減毒活疫苗相比，該重組疫苗的免疫原性和保護(hù)性還需要進(jìn)一步探索。Gupta 等[44]建立了一種由布魯氏菌Omp25和L7/L12組成的二價(jià)重組疫苗，單獨(dú)和聯(lián)合免疫小鼠后，其IgG滴度增強(qiáng)，主要介導(dǎo)Th2免疫反應(yīng)，結(jié)果表明，Omp25和L7/L12組合使用作為二價(jià)疫苗更有優(yōu)勢(shì)。關(guān)于布魯氏菌外膜蛋白作為診斷和疫苗的可能性還有很大的研究空間，其成本低、安全性能好、方便快捷等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)有待進(jìn)一步挖掘。

5 小結(jié)

現(xiàn)行的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法主要基于脂多糖抗原(LPS)、全菌蛋白、粗制外膜蛋白、鹽析蛋白、酚鹽蛋白等菌體來(lái)源的天然抗原，會(huì)與革蘭氏陰性細(xì)菌(如小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可能會(huì)給出假陽(yáng)性結(jié)果。研制快速、準(zhǔn)確的診斷試劑是早發(fā)現(xiàn)、早治療布魯氏菌病的關(guān)鍵，且安全有效的疫苗對(duì)布魯氏菌病的預(yù)防也必不可少，而外膜蛋白研究的興起為布魯氏菌病的診斷及疫苗研制提供了更大的可能性。對(duì)外膜蛋白的深入研究不僅有助于了解布魯氏菌與宿主的相互作用, 而且對(duì)建立敏感性和特異性高的診斷方法及制備新型亞單位疫苗具有重要的意義。