楊奉源，范譯心，鄧文卓，杜曉陽，李 鈾,2*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心 甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030）

麻蜥屬（ Eremias ）作為蜥蜴目（Lacertiformes）蜥蜴科（Lacertian）的一屬，全世界有30余個物種，廣泛分布于非洲、歐洲以及亞洲中西部的溫帶和暖溫帶。在中國有麗斑麻蜥（Eremias argus）、山地麻蜥（Eremias brenchleyi）、敏麻蜥（Eremias arguta）、密點麻蜥（Eremias multiocellata）、荒漠麻蜥（Eremias przewalskii）、快步麻蜥（Eremias velox）、網(wǎng)紋麻蜥（Eremias grammica）和蟲紋麻蜥（Eremias vermiculata）8個物種，主要分布于秦嶺-淮河一線以北[1]。麻蜥是典型的草原和荒漠動物，其生存環(huán)境揭示了重要生態(tài)屏障的諸多特點，可作為評估生態(tài)環(huán)境的重要參考因素[2]。麗斑麻蜥和山地麻蜥等物種還具有顯著藥用價值[3]。由于自然環(huán)境的不斷變化，麻蜥屬的生存環(huán)境也發(fā)生了較大改變，密點麻蜥被列入《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》《世界自然保護聯(lián)盟2013年瀕危物種紅色名錄》，可見對其進行保護與深入研究迫在眉睫。

遺傳多樣性是指存在于生物個體內(nèi)、單個物種內(nèi)以及物種之間的基因多樣性，是一定時空范圍內(nèi)生物遺傳變異的結果，其研究多從染色體、蛋白質(zhì)和核酸3個層面應用多種技術分析生物遺傳物質(zhì)的變化情況。對于某一特定物種而言，其地理分布、生活環(huán)境、食性以及生存地域優(yōu)勢物種的不同，作為外界環(huán)境因素都會影響物種的遺傳多樣性。本文對麻蜥屬蜥蜴的遺傳多樣性進行了相關研究。

1 研究現(xiàn)狀

麻蜥由于分布范圍廣，生存環(huán)境差異顯著，種間存在遺傳信息交互，提升了遺傳多樣性。有研究基于13個蛋白編碼基因構建系統(tǒng)發(fā)生樹的結果顯示，整個麻蜥屬是一個單系群，荒漠麻蜥和密點麻蜥遺傳距離較近，與麗斑麻蜥和山地麻蜥分聚成一個并系群，敏麻蜥、快步麻蜥、網(wǎng)紋麻蜥和蟲紋麻蜥與該并系群的親密度逐層遞減。劉金龍等[4]通過2種分子標記研究亞洲中部干旱區(qū)快步麻蜥的系統(tǒng)地理學分布，結果顯示快步麻蜥在山脈隆升、冰期循環(huán)等環(huán)境因素的影響下逐漸形成多個分支。陳紹勇等[5]在對麗斑麻蜥地理種群繁殖特征的研究中提出，運動能力、躲避天敵能力、繁殖能力等因素在長期自然選擇的作用下能改變其性狀?？梢娐轵釋龠z傳多樣性的成因多見于物種遷徙、環(huán)境因素變化及自然選擇等方面，而多樣的研究方法為揭示其內(nèi)在聯(lián)系提供了可靠手段。

2 研究方法

2.1 核型分析

2.1.1內(nèi)容 核型即染色體核型，通過判斷核型的共同特征，如公式、染色體相對長度、位置等，比較染色體的數(shù)量、形態(tài)，進而判斷其發(fā)生演化的程度，并推測產(chǎn)生差異的原因[6]。

2.1.2方法 選取樣本動物正常分裂細胞組織直接制片，對于不同麻蜥樣本分別觀察50～100個分裂相，并在其中選取5～10個較清晰的，利用秋水仙素處理使其停留在分裂中期[7]，顯微鏡下觀察染色體的數(shù)量及形態(tài)特征，并進行比對完成核型分析。

萬宏富等[8]采用常規(guī)骨髓細胞制片法對甘肅民勤縣的荒漠麻蜥的染色體進行核型分析，通過核型演化情況進一步闡明了荒漠麻蜥的系統(tǒng)學地位；戴鑫等[9]以大腿骨髓細胞為原料研究6種麻蜥的核型差異，并基于著絲粒、二倍體數(shù)、銀帶核型等參考因素的不同，分別討論了6種麻蜥物種的分化情況。

2.1.3特點 對于存在明顯遺傳差異的個體可通過核型分析簡單而高效地辨明，且在演化過程中目標物種是否經(jīng)歷過三倍體的形成并導致后續(xù)生殖隔離的出現(xiàn)，核型分析是一種較為直觀的檢測手段。由于核型分析僅通過光學顯微鏡觀察染色體的形態(tài)學特征，因此對于遺傳差異較小的變化監(jiān)測還尚存困難，對于遺傳差異的成因還缺乏更深層面的理論解釋。

2.2 線粒體基因分析

2.2.1內(nèi)容 線粒體DNA（mtDNA）是動物體內(nèi)唯一長期、穩(wěn)定存在的核外基因組，與核糖體DNA相比其分子質(zhì)量較小、呈環(huán)形，且為單倍體，在世代間沒有基因重組，呈嚴格母系遺傳，廣泛用于動物起源進化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動物經(jīng)濟性狀的核外基因效應研究。

2.2.2方法 對線粒體基因組各片段相對應的特異性引物進行PCR擴增，將所得產(chǎn)物送樣測序，由于線粒體基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，故對于測序結果的篩選校對后排除錯誤或重復的堿基序列，能實現(xiàn)對該物種mtDNA基因組全序列的測序。對測定的麻蜥種屬線粒體基因組的進一步分析，可參考Genbank數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)的麻蜥mtDNA序列?？赏ㄟ^MEGA軟件確定線粒體的結構和堿基含量。通過整合不同種麻蜥的mtDNA基因組，可根據(jù)統(tǒng)計學原理，應用極大似然法、貝葉斯法或主成分分析法等建立系統(tǒng)進化樹[10]。

郭憲光等[11]基于線粒體16SrRNA基因序列研究麻蜥屬部分物種的系統(tǒng)發(fā)育關系，并利用貝葉斯算法估計種間分化情況；蘇珊[12]對2種麻蜥的線粒體中性標記（COI、Cytb）進行差異比較，了解各物種在不同地區(qū)的種群遺傳結構以及基因流水平，發(fā)現(xiàn)麻蜥種群間的形態(tài)分化以及代謝率與環(huán)境相關；鐘文等[13]對新疆地區(qū)5個不同地域的密點麻蜥線粒體DNA采用多種統(tǒng)計學方法構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)了荒漠麻蜥、山地麻蜥與密點麻蜥的親緣關系，更進一步明晰了該地區(qū)麻蜥的遺傳進化情況。

2.2.3特點 以線粒體基因作為分子標記研究麻蜥種屬的進化關系能夠從基因?qū)用孢M一步揭示各種屬的遺傳差異，進而反饋區(qū)分研究物種的祖先與后代、同系分支等差異。MEGA軟件分析線粒體的結構組成，能體現(xiàn)單一物種線粒體基因組特征、起始密碼子與終止密碼子的差異。對于其中的tRNA基因，也可以反映出其經(jīng)典二級結構。以此為基礎可進一步構建系統(tǒng)進化樹，通常應用極大似然法、最大簡約法、貝葉斯法和距離法，能夠準確直觀反映出麻蜥屬的遺傳距離和關系，可結合環(huán)境因素判斷種群的遷移情況與親緣關系。

2.3 微衛(wèi)星分子標記

2.3.1內(nèi)容 微衛(wèi)星DNA又叫簡單重復序列（simple sequence repeat,SSR），是一類由1～6個核苷酸串聯(lián)重復排列的DNA序列，在原核生物和真核生物基因組分布廣泛且呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性水平，因而被開發(fā)成分子標記并得到廣泛應用。對中性分子標記而言，多態(tài)性水平通常與突變率呈正相關。

2.3.2方法 取物種的組織提取基因組DNA，并選取特異性引物采用PCR進行擴增，對擴增產(chǎn)物做等位基因分型。在SSR的多態(tài)性分析中，常結合統(tǒng)計學原理，通過研究其等位基因頻率、雜合度、遺傳平衡等說明物種變異程度的高低。由于物種存在遷移，因此種間基因可能發(fā)生流通，從而推動物種的進化過程。為了進一步研究物種遺傳進化規(guī)律，探明種群遷移帶來的影響，可結合基因流分析更深入地研究不同種間的進化關系。

趙丹等[14]通過擴增胎生蜥蜴組織提取的微衛(wèi)星DNA，利用Quantity One軟件分析親代與子代等位基因的差異，并用Gervus計算多態(tài)性信息含量，用于研究遺傳多樣性。趙丹等[15]發(fā)現(xiàn)目前GenBank公布我國已針對15種蜥蜴開發(fā)出278個微衛(wèi)星位點，聚合酶鏈式反應（PCR）、尼龍膜富集法、AFLP富集法、基因組文庫法等可用于微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)，并將結果應用于遺傳學分析、親權情況、種群結構分析等方面。

2.3.3特點SSR在生物體內(nèi)分布廣泛，因此帶來較高的多態(tài)性，適用于研究遷徙頻繁、生活環(huán)境復雜、分布廣泛且習性不盡相同的物種，能夠體現(xiàn)其進化演變歷史，因此在近年來關于麻蜥屬遺傳相關的研究中，微衛(wèi)星作為分子標記成為應用熱門。

2.4 SNP（單核苷酸多態(tài)性）

2.4.1內(nèi)容 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism）為染色體基因中單個核苷酸發(fā)生突變（一般為單個堿基出現(xiàn)的缺失、倒序、置換、插入等），作為第三代分子標記被廣泛使用[16]。

2.4.2方法 對于SNP最為直接準確的檢測方法是直接測序，通過對擴增得到的不同樣本的相同基因，使用設計的特異性載體結合檢測，可以準確得到單個核苷酸的突變類型和位置。除此之外，還可設計DN芯片，應用變性高效液相色譜和質(zhì)譜檢測等方法，是一類隨著生物技術的不斷發(fā)展形成的高通量、自動化程度較高的新型檢測方法。

目前SNP作為一類新型分子標記，已廣泛應用于其他爬行類研究，可為今后麻蜥屬的研究提供參考。祁玥[7]在關于南疆沙蜥系統(tǒng)地理學的研究中，選取采樣的南疆沙蜥DNA構建GBS文庫，篩選獲得高質(zhì)量SNPs并進行雜合度分析，包括觀測雜合度和期望雜合度，并基于鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，設置參數(shù)，應用Treebest1.9.2軟件計算遺傳距離，分析南疆沙蜥的種群遺傳結構，證明各個群體間遺傳差異顯著。

2.4.3特點 與多數(shù)分子標記一樣，SNP在生物體內(nèi)數(shù)量多且分布較為廣泛，遺傳變異相對穩(wěn)定也使得其結果更具代表性，且SNP多屬于二等位基因，便于自動化分析，適用于對大基數(shù)樣本的快速分析[17]。

3 討論

對于麻蜥屬蜥蜴遺傳多樣性的分析，目前研究趨勢從核型表征方面已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)向基因?qū)用?，對于不同種類分子標記的應用也已成為研究熱點。不同的分子標記其本質(zhì)都是對于基因突變應用的新詮釋，分子標記所要求具有的特點共性都是具有較高的多態(tài)性，便于基于突變研究物種進化情況和種間關系，同時穩(wěn)定性與檢測方式的準確性也成為選擇分子標記的參考標準。以遺傳變異為動力的遺傳多樣性研究，即遺傳信息在傳遞過程中可能發(fā)生基因?qū)用娴耐蛔兓蛑亟M而造成遺傳信息的變化，進而形成了物種的遺傳多樣性變化，包括不同群體和同一群體不同個體的遺傳多樣性。對于動物群體遺傳多樣性的研究能夠系統(tǒng)追溯該動物群體的生物進化歷史，分子標記的使用也應根據(jù)其特點綜合分析。微衛(wèi)星DNA相比線粒體DNA的分子量更小，多態(tài)性水平更高，能夠反映短期內(nèi)物種的進化關系；線粒體DNA序列變異速度相對于微衛(wèi)星DNA較慢，能夠反映相對較長的時間段內(nèi)物種的遺傳結構，在對遺傳結構研究的時間尺度上形成了較全面的相互補充。而分散取樣又能夠從空間尺度印證遺傳多樣性對種群棲息地分布帶來的影響。第三代分子標記SNP則擁有簡單快速準確的分析優(yōu)勢，可結合上述2種分子標記進一步提升研究層次。利用分子標記對遺傳距離的獲取可為現(xiàn)存生物的進化潛能評估提供數(shù)據(jù)基礎，結合進化時間尺度的分析能預測未來進化趨勢，而氣候、土壤條件、濕度等一系列生境因子又能夠反作用于生物的進化過程，從而進一步擴大生物遺傳多樣性。