張 姍，劉兆睿，劉 潔

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1皮膚科 國家皮膚與免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 2疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730

絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，在胚胎發(fā)育、組織重構(gòu)、細(xì)胞分化、血管形成等多種生理過程中均發(fā)揮重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitors，serpins)超家族是一類大小相似、結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白質(zhì)分子，幾乎存在于所有生命體中，目前已發(fā)現(xiàn)超過1000個(gè)家族成員，serpins可作為自殺性底物與絲氨酸蛋白酶結(jié)合，通過形成共價(jià)抑制復(fù)合物而調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的活性，參與調(diào)控體內(nèi)一系列蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如補(bǔ)體激活、凝血、細(xì)胞凋亡等。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化研究，serpins被分為16個(gè)亞家族[1]，其中人類基因組可編碼9個(gè)亞家族(A～I(xiàn)族)serpins[2]。B族serpins被稱為卵清蛋白樣絲氨酸蛋白酶抑制劑，與其他大多數(shù)serpins為細(xì)胞外蛋白不同，B族serpins缺乏經(jīng)典的N末端信號(hào)肽，主要存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，保護(hù)細(xì)胞免受外源性和內(nèi)源性蛋白酶介導(dǎo)的損傷[3]。

SerpinB9是B族serpins成員之一，是顆粒酶B(granzyme B，GrB)的生理性抑制劑，存在于多種免疫細(xì)胞中，參與人體內(nèi)病毒感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等多種過程。已有研究發(fā)現(xiàn)SerpinB9與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等疾病相關(guān)[4]。近年來，SerpinB9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究熱點(diǎn)，并有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)之一。皮膚惡性腫瘤種類繁多，晚期進(jìn)展迅速、預(yù)后差，尚無有效的治療手段，研究SerpinB9在皮膚腫瘤發(fā)生中的作用并探索其作為治療靶點(diǎn)的可能性具有重要臨床意義。本文將對(duì)SerpinB9與腫瘤的關(guān)系及其在皮膚腫瘤領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 SerpinB9功能

通過死亡受體途徑和細(xì)胞毒性顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)殺滅靶細(xì)胞的主要方式，細(xì)胞毒性顆粒內(nèi)含有可溶解細(xì)胞膜的穿孔素及多種顆粒酶，其中GrB是誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子。GrB是一種外源性絲氨酸蛋白酶，可與靶細(xì)胞表面的磷酸甘露糖受體結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-3、caspase-7等，導(dǎo)致DNA裂解并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[5]。

Sun等[6]研究發(fā)現(xiàn),SerpinB9是GrB的生理性抑制劑，通過與GrB結(jié)合形成共價(jià)復(fù)合物而抑制其功能，進(jìn)而抑制穿孔素/顆粒酶途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)SerpinB9主要存在于CTL及B細(xì)胞中，推測(cè)在免疫應(yīng)答過程中，淋巴細(xì)胞通過產(chǎn)生SerpinB9滅活內(nèi)源性或外源性GrB，從而抵抗GrB對(duì)自身的殺傷作用，其為淋巴細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制之一。隨后的多項(xiàng)研究均證實(shí)了這一觀點(diǎn)[7-8]。Bird等[9]通過研究進(jìn)一步證實(shí),SerpinB9可特異性抑制GrB而不影響Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使CTL可通過Fas途徑進(jìn)行自我清除，從而維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。近年來，一些研究表明SerpinB9同樣可與活化的caspase-8、caspase-10相互作用，抑制下游caspase的激活，進(jìn)而抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)、Fas等死亡受體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10-11]。

2 SerpinB9分布

SerpinB9分布廣泛，除在CTL中發(fā)揮自我保護(hù)作用外，在樹突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、脾邊緣區(qū)B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞中同樣可檢測(cè)到SerpinB9的表達(dá)。通過抑制其在免疫應(yīng)答過程中可能接觸到的內(nèi)源性或外源性GrB而避免了異常自身凋亡，從而發(fā)揮抗原交叉提呈、啟動(dòng)免疫反應(yīng)、保持血管完整性等生理作用[12-16]。此外，免疫豁免部位的細(xì)胞，如胎盤組織的中間滋養(yǎng)細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞和晶狀體細(xì)胞也可產(chǎn)生SerpinB9以保護(hù)自身免受免疫系統(tǒng)攻擊，維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[12]。

3 SerpinB9與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系

CTL的殺傷作用是機(jī)體實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫的主要途徑，而腫瘤細(xì)胞可通過多種途徑逃脫免疫監(jiān)視以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，如下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ類分子的表達(dá)、產(chǎn)生凋亡抑制蛋白c-FLIP進(jìn)而抑制死亡受體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等[5,17]。近年來，SerpinB9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究的熱點(diǎn)。Medema等[5]在人和小鼠的乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞中均檢測(cè)到SerpinB9表達(dá)，而在正常乳腺上皮細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)SerpinB9表達(dá)，且SerpinB9高表達(dá)可顯著抑制CTL通過穿孔素/顆粒酶途徑介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，表明SerpinB9的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞抵抗CTL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的機(jī)制之一，而SerpinB9的表達(dá)水平可用于評(píng)估CTL介導(dǎo)的腫瘤免疫治療可行性。

Rousalova等[18]研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和組織表達(dá)SerpinB9，且可抑制GrB的活性。Soriano等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與正常支氣管上皮細(xì)胞相比，肺癌細(xì)胞中SerpinB9表達(dá)升高，而腫瘤相關(guān)CD8+T細(xì)胞中GrB的表達(dá)水平下調(diào);且在非小細(xì)胞肺癌中，隨著腫瘤進(jìn)展SerpinB9的表達(dá)逐漸上升，表明SerpinB9表達(dá)升高與預(yù)后不良相關(guān)。Zhou等[20]在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，肝癌細(xì)胞中SerpinB9的表達(dá)水平顯著高于正常肝組織，SerpinB9的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤體積呈正相關(guān)，且是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，SerpinB9高表達(dá)組患者的生存時(shí)間顯著短于SerpinB9低表達(dá)組。Vycital等[21]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織和正常結(jié)腸組織中均可檢測(cè)到SerpinB9的表達(dá)，且正常結(jié)腸組織中SerpinB9表達(dá)升高的患者總生存期更長(zhǎng)，推測(cè)該結(jié)果體現(xiàn)了抗腫瘤免疫反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞的相互作用對(duì)預(yù)后的影響，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。Ray等[22]發(fā)現(xiàn)早期前列腺癌細(xì)胞中SerpinB9表達(dá)升高，并可抑制NK細(xì)胞釋放的GrB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明SerpinB9表達(dá)上調(diào)可能是促進(jìn)早期前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制之一。

除實(shí)體腫瘤外，一些血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞同樣也表達(dá)SerpinB9。Fritsch等[23]發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病的腫瘤細(xì)胞表達(dá)SerpinB9，且SerpinB9表達(dá)水平與GrB活性呈負(fù)相關(guān)。隨著SerpinB9表達(dá)水平升高，其對(duì)GrB的抑制程度增加，腫瘤細(xì)胞的凋亡水平降低，推測(cè)SerpinB9可通過抑制GrB減少腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)硼替佐米抵抗的復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤患者中，其骨髓單個(gè)核細(xì)胞的SerpinB9表達(dá)水平顯著高于多發(fā)性骨髓瘤的新診初治患者，功能富集分析提示SerpinB9參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、程序性細(xì)胞死亡和免疫應(yīng)答等過程，推測(cè)SerpinB9有望成為復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤的潛在治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

4 SerpinB9與皮膚腫瘤

4.1 SerpinB9與惡性黑色素瘤

4.1.1 促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞免疫逃逸

在皮膚腫瘤領(lǐng)域關(guān)于SerpinB9的研究中，惡性黑色素瘤是報(bào)道最多、研究較為廣泛的疾病。Medema等[5]發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到SerpinB9表達(dá)，SerpinB9通過滅活GrB抵抗CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而在正常黑色素細(xì)胞中SerpinB9表達(dá)陰性，表明惡性黑色素瘤細(xì)胞可能通過表達(dá)SerpinB9逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊與殺傷作用。

在惡性黑色素瘤治療方面，免疫治療是近年來的研究熱點(diǎn)之一。多項(xiàng)研究表明，SerpinB9的表達(dá)水平與惡性黑色素瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)相關(guān)。在接受特異性主動(dòng)免疫治療的轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤患者中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)SerpinB9的患者對(duì)免疫治療反應(yīng)較差，且預(yù)后不良，提示腫瘤細(xì)胞表達(dá)SerpinB9可能為一種重要的免疫逃逸機(jī)制，調(diào)控SerpinB9的表達(dá)水平可能是增強(qiáng)免疫治療療效的途徑之一[25]。在使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗CTLA-4單克隆抗體易普利姆瑪(ipilimumab)治療惡性黑色素瘤的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，治療有效組患者的SerpinB9表達(dá)水平較無應(yīng)答組更低，SerpinB9表達(dá)水平升高與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)[26-27]。Jiang等[27]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SerpinB9高表達(dá)與惡性黑色素瘤對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療抵抗相關(guān)，而惡性黑色素瘤細(xì)胞對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療反應(yīng)與CTL介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明，敲除SERPINB9基因的B16F10細(xì)胞(小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞)對(duì)CTL介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用更敏感；而SERPINB9基因過表達(dá)的B16F10細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用表現(xiàn)出抵抗。

4.1.2 通過影響腫瘤微環(huán)境促進(jìn)惡性黑色素瘤發(fā)展

SerpinB9除在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高以促進(jìn)免疫逃逸、免疫治療抵抗外，還可通過影響腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

TME包括腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管、信號(hào)分子和細(xì)胞外基質(zhì)等，TME與腫瘤細(xì)胞不斷相互作用，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等生物學(xué)行為[28]。TME中的髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)及調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞等免疫細(xì)胞構(gòu)成了免疫抑制性TME，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲。而TME中的間質(zhì)細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor-associated fibroblast，CAF)可分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)蛋白等，阻礙效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[29-30]。

Luo等[31]對(duì)葡萄膜黑色素瘤TME中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了包括SERPINB9基因在內(nèi)的21個(gè)與預(yù)后相關(guān)的基因。Jiang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤TME中的MDSC、TAM、Treg細(xì)胞等抑制性免疫細(xì)胞同樣表達(dá)SerpinB9，并通過抑制殺傷性淋巴細(xì)胞(CTL、NK細(xì)胞)分泌的或內(nèi)源性GrB而發(fā)揮自我保護(hù)作用，進(jìn)而形成有利于腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的TME，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。該團(tuán)隊(duì)還通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)在SERPINB9基因缺陷的惡性黑色素瘤小鼠中，Treg、MDSC、TAM的比例及CAF的數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，提示抑制SerpinB9可逆轉(zhuǎn)免疫抑制性TME，增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫活性，并通過抑制腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的功能阻礙腫瘤的發(fā)展。

4.2 SerpinB9與皮膚鱗狀細(xì)胞癌

器官移植后繼發(fā)皮膚鱗狀細(xì)胞癌是其嚴(yán)重并發(fā)癥之一，Peters等[32]對(duì)腎移植患者的循環(huán)T細(xì)胞進(jìn)行了全基因組甲基化分析，發(fā)現(xiàn)腎移植后繼發(fā)皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的T細(xì)胞中SERPINB9基因的甲基化水平顯著高于非鱗狀細(xì)胞癌，且外周T細(xì)胞中SerpinB9的表達(dá)水平低于對(duì)照組。推測(cè)T細(xì)胞中SERPINB9基因的表觀遺傳調(diào)控紊亂可能與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，通過表觀修飾降低SERPINB9基因甲基化水平或許是預(yù)防移植后鱗狀細(xì)胞癌的靶點(diǎn)之一。

4.3 SerpinB9與皮膚淋巴瘤

皮膚淋巴瘤是一組異質(zhì)性疾病，原發(fā)性皮膚淋巴瘤的發(fā)生率在結(jié)外非霍奇金淋巴瘤中占第2位，同時(shí)原發(fā)結(jié)內(nèi)的淋巴瘤也可出現(xiàn)皮膚受累。已有研究證實(shí)，在系統(tǒng)性間變性大細(xì)胞淋巴瘤，結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤中均可檢測(cè)到SerpinB9表達(dá)陽性的瘤細(xì)胞[33-34]。ten Berge等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性間變性大細(xì)胞淋巴瘤患者中，SerpinB9表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞數(shù)目升高是預(yù)后不良的標(biāo)志。Bossard等[35]對(duì)48例結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤、鼻型患者的腫瘤細(xì)胞的SerpinB9表達(dá)水平與預(yù)后情況的分析表明，SerpinB9表達(dá)缺失是預(yù)后不良的標(biāo)志，推測(cè)由于NK細(xì)胞固有表達(dá)GrB和SerpinB9，SerpinB9的“丟失”提示腫瘤細(xì)胞去分化，因此此類患者進(jìn)展較快且預(yù)后差。

5 SerpinB9可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)

基于SerpinB9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，通過抑制SerpinB9發(fā)揮抗腫瘤作用成為近年來研究的熱點(diǎn)。SerpinB9可抑制CTL通過穿孔素/顆粒酶途徑介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，因此SerpinB9的表達(dá)水平是預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)CTL介導(dǎo)的殺傷作用的敏感性參數(shù)之一[25]。如前所述，復(fù)發(fā)性難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞中SerpinB9表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高，且SerpinB9在免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等多種生理過程中發(fā)揮調(diào)控作用，提示SerpinB9有望成為復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤的潛在治療靶點(diǎn)[24]。

Jiang等[29]篩選出了一種SerpinB9特異性抑制劑——小分子化合物3034(1，3-苯并惡唑-6-羧酸)，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了1，3-苯并惡唑-6-羧酸作用于惡性黑色素瘤細(xì)胞后可顯著提高其凋亡率，降低黑色素瘤的生長(zhǎng)速度，且在乳腺癌、腎癌、肺癌小鼠模型中均被證實(shí)具有類似的抗腫瘤效果。上述結(jié)論表明SerpinB9抑制劑具有潛在的抗腫瘤作用，可能成為多種惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

6 小結(jié)

綜上所述，SerpinB9已被證實(shí)與非小細(xì)胞肺癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤相關(guān)，并通過促進(jìn)免疫逃逸、影響TME等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在皮膚腫瘤方面，目前關(guān)于SerpinB9的研究主要集中于惡性黑色素瘤，而在其他皮膚惡性腫瘤中的表達(dá)及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探索。目前研究數(shù)據(jù)顯示，SerpinB9在腫瘤治療方面具有較大潛力，為惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌及皮膚淋巴瘤等難治性皮膚腫瘤的治療提供了新的思路和方向。

作者貢獻(xiàn)：張姍和劉兆睿負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)、撰寫及修訂論文；劉潔負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)選題和審校論文。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突