吳 南，李國(guó)壯，吳志宏，仉建國(guó)，邱貴興

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 1骨科 2骨骼畸形遺傳學(xué)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 4疑難重癥及罕見(jiàn)病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 5醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心，北京 100730

先天性脊柱側(cè)凸(congenital scoliosis，CS)是起因于胚胎期脊柱發(fā)育異常的先天性脊柱畸形，具有進(jìn)展快、畸形重、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，如未得到及時(shí)診斷和治療，隨著年齡增長(zhǎng)及身體發(fā)育，畸形逐漸加重，將影響患者的心肺功能。脊柱畸形的加重也可造成神經(jīng)功能損害，患者出現(xiàn)雙下肢感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能異常，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量及壽命。CS患者常合并椎管內(nèi)畸形、先天性心臟病、泌尿系統(tǒng)及消化道畸形等多種先天發(fā)育障礙[1]，手術(shù)治療極為困難，且嚴(yán)重畸形可能需要多次矯形手術(shù)，給患者及家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力[2]。

2018年，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)、科技部、工業(yè)和信息化部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局、國(guó)家中醫(yī)藥管理局等五部門(mén)聯(lián)合發(fā)布了《第一批罕見(jiàn)病》目錄，共涉及121種疾病，CS即包含其中[3]。2021年，國(guó)務(wù)院辦公廳在《國(guó)家殘疾預(yù)防行動(dòng)計(jì)劃(2021—2025年)》中明確聚焦骨骼肌肉等先天性結(jié)構(gòu)畸形，開(kāi)展篩查診治等工作，促進(jìn)早發(fā)現(xiàn)早治療，減少先天性骨骼畸形所致的殘疾。2022年，全國(guó)衛(wèi)生健康工作會(huì)議提出深入推進(jìn)健康中國(guó)行動(dòng)，推進(jìn)脊柱側(cè)彎監(jiān)測(cè)等學(xué)校健康工作，教育部也在答復(fù)政協(xié)提案的函中表示將脊柱彎曲異常納入學(xué)生常見(jiàn)病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)。但是，目前對(duì)于CS的篩查方式匱乏，針對(duì)病因的治療尚無(wú)良策。因缺乏早期預(yù)測(cè)手段，患者多在出現(xiàn)外觀畸形時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，治療方法僅能以保守性的支具或創(chuàng)傷性的手術(shù)控制病情發(fā)展。因此，探索CS早期的診斷方法和有效的病因?qū)W干預(yù)靶點(diǎn)是當(dāng)前國(guó)際研究的熱點(diǎn)。

近10年來(lái)，北京協(xié)和骨科團(tuán)隊(duì)相繼牽頭建立了“系統(tǒng)解析脊柱畸形及相關(guān)合并癥”(Deciphering disorders Involving Scoliosis and COmorbidities，DISCO，http://discostudy.org/)研究協(xié)作組，構(gòu)建了我國(guó)首個(gè)國(guó)際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系，發(fā)現(xiàn)并論證了TBX6基因無(wú)效變異聯(lián)合常見(jiàn)亞效等位基因共同導(dǎo)致CS，首次定義了一種全新的CS疾病亞型——TBX6相關(guān)先天性脊柱側(cè)凸(TBX6-associated congenital scoliosis，TACS)，搭建了TACScore預(yù)測(cè)系統(tǒng)以評(píng)估臨床TACS的患病風(fēng)險(xiǎn)，建立了TACS基因劑量模型。該模型獲得了世界廣泛認(rèn)可，被命名為“中國(guó)模型”，為學(xué)界深入理解CS的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。同時(shí)，我國(guó)首個(gè)骨骼畸形遺傳門(mén)診在北京協(xié)和醫(yī)院建立，實(shí)現(xiàn)了研究成果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 一種古老而又年輕的疾病——CS

CS是指由胚胎期脊柱發(fā)育異常引起的先天性脊柱畸形，根據(jù)其椎體發(fā)育異常情況，可分為形成障礙型(CS Ⅰ型)、分節(jié)不良型(CSⅡ型)及混合型(CSⅢ型)三種[4]。CS在新生兒中的發(fā)病率約為(0.5～1)/1000[5]。在臨床上，CS指因椎體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致脊柱Cobb角>10°，大體表現(xiàn)為直立時(shí)兩肩不等高、胸廓不對(duì)稱，出現(xiàn)一側(cè)腰部皺褶皮紋、向前彎腰出現(xiàn)兩側(cè)背部不對(duì)稱(“剃刀背”)，有時(shí)可見(jiàn)兩側(cè)骨盆不對(duì)稱等。此外，CS還可伴發(fā)其他系統(tǒng)缺陷，如椎管內(nèi)畸形、先天性心臟病以及先天性腎輸尿管發(fā)育異常等。

CS具有進(jìn)展快、畸形重、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，部分患者可進(jìn)展為嚴(yán)重的脊柱側(cè)凸或后凸畸形，造成神經(jīng)功能損害甚至癱瘓。此外，有的患者可并發(fā)胸廓發(fā)育異常，嚴(yán)重影響心肺功能，甚至導(dǎo)致心肺功能衰竭而死亡。CS患者通常年齡較小，心肺功能差，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，有時(shí)需多次手術(shù)矯形，給患者及家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，成為嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民尤其是兒童和青少年健康的重大疾病。

CS是一種古老而又年輕的疾病。說(shuō)其古老是因?yàn)樵缭?885年出版的BodilyDeformitiesandTheirTreatment一書(shū)中即有關(guān)于CS的詳細(xì)描述，作者根據(jù)其臨床觀察推測(cè)CS的成因?yàn)樨E病所致的椎體結(jié)構(gòu)缺陷，骨骼形態(tài)異?；蛱簩m內(nèi)位置異常等[6]；截至目前使用最廣泛的CS分型仍為Winter等[4]于1968年根據(jù)椎體形態(tài)異常提出的分型。說(shuō)其年輕是因?yàn)镃S病因復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外對(duì)其病因?qū)W的認(rèn)識(shí)直至近年才有所突破。

近些年，隨著基因分析技術(shù)的不斷成熟和成本大幅下降，對(duì)CS的分子遺傳學(xué)研究愈發(fā)深入，其中以單基因遺傳模型的研究成果最為顯著。大規(guī)?；蚪M分析技術(shù)的臨床應(yīng)用，使研究人員得以運(yùn)用先進(jìn)的遺傳學(xué)分析方法，系統(tǒng)解析CS單基因致病因素，探索CS的致病機(jī)制，提高其分子診斷率。

2 TBX6基因在脊柱發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用

脊柱發(fā)育起源于中胚層，依據(jù)其位置和未來(lái)將發(fā)育成的結(jié)構(gòu)，將中胚層自脊索向兩側(cè)分為軸旁中胚層、間質(zhì)中胚層和側(cè)板中胚層。軸旁中胚層將分化為節(jié)段性結(jié)構(gòu)，稱為體節(jié)，此過(guò)程稱為體節(jié)發(fā)生。體節(jié)是脊柱發(fā)育的前體，可進(jìn)一步分化為生骨節(jié)和生皮肌節(jié)。每側(cè)體節(jié)腹內(nèi)側(cè)面分出的生骨節(jié)細(xì)胞逐漸移向胚胎中線的脊索周?chē)?，圍繞神經(jīng)管和脊索形成脊柱。起初生骨節(jié)組織的節(jié)段包繞脊索與體節(jié)對(duì)應(yīng)，當(dāng)進(jìn)一步發(fā)育時(shí)，每個(gè)生骨節(jié)的尾端部分變致密，并與下位生骨節(jié)的頭端連接起來(lái)，形成新的節(jié)段稱椎骨原基，即后來(lái)的椎體。椎體形成后不久，在其背面伸出密集的間充質(zhì)，形成神經(jīng)弓，包圍脊髓。腹面形成肋突，肋突在胸椎形成肋骨，在頸椎、腰椎與橫突相合。椎骨原基形成軟骨，而后骨化為椎體。

脊柱的分節(jié)及包繞神經(jīng)管是一個(gè)復(fù)雜的演化發(fā)育過(guò)程，在發(fā)育過(guò)程中干擾軸旁中胚層、體節(jié)或軸骨的發(fā)生均可導(dǎo)致脊椎的發(fā)育缺陷，形成半椎、楔椎、蝴蝶椎、融合椎、移行椎等先天性骨性畸形，從而導(dǎo)致CS。體節(jié)發(fā)生過(guò)程主要受到WNT、FGF和Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，接受最為廣泛的體節(jié)發(fā)生模型為時(shí)鐘波前模型，于1976年由Cooke等[7]首次提出。Pourquie[8]進(jìn)一步驗(yàn)證了分節(jié)時(shí)鐘的存在，識(shí)別出Notch信號(hào)通路在體節(jié)形成中發(fā)揮重要作用。循環(huán)基因的表達(dá)具有周期性，在形成一個(gè)體節(jié)的過(guò)程中通過(guò)前體節(jié)中胚層(presomitic mesoderm，PSM)形成一個(gè)表達(dá)波。Notch信號(hào)通路對(duì)于相鄰節(jié)段混雜的PSM細(xì)胞的分離和體節(jié)內(nèi)前后方向的形成至關(guān)重要[9]。在時(shí)鐘波前模型中，PSM在Notch信號(hào)通路的作用下逐漸分割為重復(fù)的體節(jié)。分節(jié)時(shí)鐘和波前由一系列相關(guān)基因和信號(hào)通路產(chǎn)物組成。參與Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)過(guò)程的TBX6基因在體節(jié)發(fā)生過(guò)程中起重要作用。

TBX6基因是脊柱發(fā)育過(guò)程中的重要基因，被稱為T(mén)-box 6，是T-box家族的一員。TBX6基因定位于16號(hào)染色體短臂1區(qū)1帶2亞帶，大小為6095 bp，包含9個(gè)外顯子。對(duì)于TBX6的研究主要是通過(guò)研究位于小鼠基因組的第7號(hào)染色體的同源基因Tbx6進(jìn)行[10]。Tbx6編碼一條長(zhǎng)1.9 kb的轉(zhuǎn)錄因子，首先在小鼠原腸胚階段中的早期原條和新招募的近軸中胚層表達(dá)，發(fā)育后期Tbx6的表達(dá)僅限于前體節(jié)、近軸中胚層和尾芽。Tbx6在尾芽的表達(dá)一直持續(xù)至受精后12.5 d，在受精后13.5 d停止。因此，Tbx6的表達(dá)在原條、尾芽和PSM的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，Tbx6突變影響了軸旁中胚層的分化[11]。TBX6與時(shí)鐘波前模型相關(guān)基因或TBX6本身的相互作用可導(dǎo)致體節(jié)發(fā)育異常，從而導(dǎo)致CS[12-13]。

3 發(fā)現(xiàn)CS重要致病模型并實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用

北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)基于牽頭建立的多中心、多人種DISCO國(guó)際協(xié)作組，運(yùn)用自主研發(fā)的隊(duì)列基因數(shù)據(jù)分析體系(Peking Union Medical college hospital Pipeline，PUMP)，領(lǐng)導(dǎo)了多項(xiàng)世界多中心、多人種研究。運(yùn)用多種先進(jìn)的遺傳學(xué)分析方法，結(jié)合體內(nèi)體外功能實(shí)驗(yàn)，闡釋了TBX6復(fù)合變異導(dǎo)致CS的致病機(jī)制及特點(diǎn)，定義了一種全新的CS亞型——TACS，提出并推動(dòng)TACS的“中國(guó)模型”走向世界舞臺(tái)。

3.1 構(gòu)建我國(guó)首個(gè)國(guó)際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系

依托骨骼畸形遺傳學(xué)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院脊柱畸形大數(shù)據(jù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等平臺(tái)，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)牽頭建立DISCO國(guó)際協(xié)作組，與世界范圍內(nèi)各研究組開(kāi)展廣泛合作，建立CS遺傳咨詢與研究體系。通過(guò)主持多項(xiàng)世界多中心、多人種骨骼畸形及相關(guān)疾病隊(duì)列研究，開(kāi)發(fā)了國(guó)際領(lǐng)先的疾病隊(duì)列基因組分析體系PUMP，搭建了從樣本采集、數(shù)據(jù)解讀到臨床轉(zhuǎn)化的全鏈條平臺(tái)?；赑UMP，針對(duì)骨骼畸形發(fā)生的不同生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行多維度探索，進(jìn)一步解析CS及骨骼同源胚層疾病的遺傳病因。

3.2 發(fā)現(xiàn)并論證TBX6基因無(wú)效變異聯(lián)合常見(jiàn)亞效等位基因共同導(dǎo)致CS

早在2010年，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了CS患者中TBX6基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，提示TBX6基因的遺傳變異與CS發(fā)病相關(guān)，并可能在中國(guó)漢族人群CS的易感性中發(fā)揮重要作用[14]。國(guó)際上亦有一些文獻(xiàn)報(bào)道TBX6基因變異可能與脊柱畸形相關(guān)[15-16]。北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊(duì)率先完成CS全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)分析，發(fā)現(xiàn)高達(dá)10%的病例16p11.2區(qū)域存在大片段缺失型CNV，并將這一區(qū)域的TBX6基因確定為致病基因，這是迄今發(fā)現(xiàn)的對(duì)CS貢獻(xiàn)最大的單個(gè)致病位點(diǎn)。此外，在家系樣本中觀察到“不完全外顯”現(xiàn)象，提示TBX6基因的罕見(jiàn)CNV本身不足以導(dǎo)致CS，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)TBX6的罕見(jiàn)變異通常需要聯(lián)合一個(gè)常見(jiàn)的亞效SNP共同致病，該研究是目前對(duì)CS遺傳病因最重要的詮釋，為CS提供了最大宗的病因?qū)W證據(jù)[17]，也開(kāi)啟了學(xué)界對(duì)同一基因中常見(jiàn)變異聯(lián)合罕見(jiàn)突變共同致病這一全新遺傳機(jī)理的認(rèn)識(shí)，即對(duì)疾病遺傳學(xué)研究中占主導(dǎo)地位的“常見(jiàn)變異致常見(jiàn)疾病”傳統(tǒng)模型進(jìn)行了理論延伸，也對(duì)疾病遺傳學(xué)研究中漸行漸熱的“罕見(jiàn)變異致常見(jiàn)疾病”模型進(jìn)行了實(shí)例論證，闡釋常見(jiàn)變異可與罕見(jiàn)突變共同作用導(dǎo)致疾病發(fā)生的遺傳機(jī)理，為人類(lèi)遺傳學(xué)研究和研究成果的臨床應(yīng)用提供了全新思路。

3.3 首次定義一種全新的CS疾病亞型——TACS

為進(jìn)一步闡明具有臨床指導(dǎo)意義的CS表型，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)牽頭收集了世界多中心、多人種的CS疾病隊(duì)列，通過(guò)對(duì)TBX6基因變異及其上游區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)TBX6變異導(dǎo)致的CS均表現(xiàn)為半椎體或蝴蝶椎，且多集中于脊柱下段受累。通過(guò)基因型-表型關(guān)聯(lián)分析，首次定義了一種全新的CS疾病亞型——TACS，并成功建立了TACScore預(yù)測(cè)系統(tǒng)以評(píng)估TACS的患病風(fēng)險(xiǎn)[18]。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)將開(kāi)發(fā)的TACS分子診斷及臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型融入到臨床診療流程，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)TACS的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，其研究成果先后得到了法國(guó)[19]、日本[20-21]、意大利[22]和中國(guó)香港[23]4個(gè)研究組分別在歐洲、日本和中國(guó)南方人群隊(duì)列的獨(dú)立重復(fù)。

為進(jìn)一步解析TACS的發(fā)病機(jī)制，團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Tbx6無(wú)義和亞效等位基因小鼠，成功建立了TBX6劑量梯度模型與CS表型之間的確切關(guān)系，并在小鼠模型中再現(xiàn)了人類(lèi)TBX6無(wú)效變異聯(lián)合亞效等位基因的遺傳模型，發(fā)現(xiàn)Tbx6基因編輯的小鼠模型與TACS患者表型完全一致[24]。Tbx6基因敲除小鼠模型成功模擬了人類(lèi)TBX6基因變異導(dǎo)致的CS表型，為研究TBX6基因在人類(lèi)CS致病機(jī)理方面提供了有效的動(dòng)物模型。

由TBX6基因復(fù)合雜合突變所致的TACS為主要累及胸腰段的半椎體或蝴蝶椎等單純先天性脊柱畸形，屬于TACS Ⅰ型。但仍有部分TACS患者的臨床表型更嚴(yán)重，在延續(xù)性工作中，團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析525例中國(guó)及美國(guó)的多人種數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了11個(gè)與CS相關(guān)的罕見(jiàn)突變，其中包括6個(gè)新的TBX6致病突變位點(diǎn)，擴(kuò)展了TBX6基因的致病譜，建立了TACS的基因劑量模型，依據(jù)更加嚴(yán)重的表型對(duì)應(yīng)更大劑量的基因缺失的現(xiàn)象，團(tuán)隊(duì)提出了TACS Ⅱ型的概念，豐富了CS的分子分型[25]。上述研究成果得到了國(guó)內(nèi)外同行的廣泛認(rèn)可，并將發(fā)現(xiàn)的全新TBX6致病遺傳模型命名為“中國(guó)模型”。

3.4 將研究成果實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化

為促進(jìn)研究成果的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)將前期建立的TACScore模型應(yīng)用于臨床工作，通過(guò)成本-效益分析，發(fā)現(xiàn)TACScore相較于全外顯子組測(cè)序，平均可為每例TACS患者節(jié)省臨床成本約3000元，將診斷速度提高13.6 d，從而改善患者的預(yù)后[26]。

臨床解讀二代測(cè)序數(shù)據(jù)流程繁復(fù)，遺傳學(xué)家需解讀近千個(gè)致病基因的變異位點(diǎn)方能找到可能的致病基因。為進(jìn)一步提高骨骼畸形臨床遺傳咨詢數(shù)據(jù)分析的速度，團(tuán)隊(duì)運(yùn)用人工智能技術(shù)，開(kāi)發(fā)了基于表型的致病基因預(yù)測(cè)模型PhenoApt[27]。該預(yù)測(cè)模型是團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的、基于人工智能算法的基因解讀工具，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域的空白。

在北京協(xié)和醫(yī)院的支持下，骨科團(tuán)隊(duì)開(kāi)設(shè)了我國(guó)首個(gè)骨骼畸形遺傳門(mén)診，美國(guó)、日本等世界各地權(quán)威學(xué)者前來(lái)訪問(wèn)并給予高度評(píng)價(jià)。團(tuán)隊(duì)參與組織北京協(xié)和醫(yī)院多學(xué)科會(huì)診百余次，運(yùn)用分子診斷方法指導(dǎo)制訂診療計(jì)劃數(shù)十次，并積極探索基于骨骼畸形病因?qū)W診斷的新診療方案，如制訂個(gè)性化手術(shù)方案、用藥方案及干預(yù)方案等，以改善患者預(yù)后，降低患者醫(yī)療負(fù)擔(dān)，真正實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)療的閉環(huán)。

4 小結(jié)與展望

北京協(xié)和醫(yī)院骨科團(tuán)隊(duì)圍繞“解析CS及同源胚層疾病遺傳病因”為研究主線，建立多中心、多人種DISCO國(guó)際研究協(xié)作組，形成國(guó)際領(lǐng)先的疾病隊(duì)列遺傳數(shù)據(jù)分析體系PUMP，開(kāi)設(shè)我國(guó)首個(gè)骨骼畸形遺傳門(mén)診。從揭示致病基因、探索致病機(jī)制、成果臨床轉(zhuǎn)化三個(gè)方面開(kāi)展延續(xù)性工作，構(gòu)建我國(guó)首個(gè)國(guó)際領(lǐng)先的骨骼畸形遺傳研究體系，揭示了骨骼畸形及相關(guān)疾病的重要遺傳病因；首次發(fā)現(xiàn)TBX6變異是CS最重要的致病基因，提出TACS這一新的分子亞型，獲得世界廣泛認(rèn)可；切實(shí)提升了我國(guó)骨科尤其是脊柱畸形遺傳學(xué)研究的整體水平和國(guó)際地位。

未來(lái)，團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)以臨床需求為導(dǎo)向，把握高通量測(cè)序技術(shù)所產(chǎn)生的大數(shù)據(jù)機(jī)遇，聚焦CS這一嚴(yán)重影響我國(guó)國(guó)民尤其是兒童和青少年健康的重大疾病，基于人工智能及大數(shù)據(jù)分析方式，尋找CS及同源胚層疾病新的遺傳病因和機(jī)制，完善CS的分子分型，實(shí)現(xiàn)對(duì)CS患者的早篩早診早治，推進(jìn)致病基因篩查的研究和應(yīng)用，探索建立疾病預(yù)防干預(yù)技術(shù)體系，開(kāi)發(fā)并完善相關(guān)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。

作者貢獻(xiàn)：吳南負(fù)責(zé)論文構(gòu)思與寫(xiě)作；李國(guó)壯負(fù)責(zé)論文初稿撰寫(xiě)；吳志宏、仉建國(guó)、邱貴興負(fù)責(zé)論文構(gòu)思及審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突