姜云鴿,席曉萌,黃相中,田 凱

云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會-教育部重點實驗室,云南 昆明 650500

胃癌(gastric cancer)是常見的消化道惡性腫瘤[1],盡管近年來早查早治的普及使胃癌的整體預(yù)后有所改善,但由于遺傳、生活習(xí)慣、細(xì)菌感染、情緒、環(huán)境等因素的影響,其發(fā)病率仍逐年增長[2]。胃癌發(fā)病率是我國所有惡性腫瘤中的第二位,死亡率居第三位,是嚴(yán)峻的醫(yī)療問題[3]。胃癌患者早期無明顯癥狀,確診時多為中晚期,伴腹部疼痛腫大、惡心嘔吐等體征[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療胃癌的手段一般為手術(shù)、放療與化療,但通常會產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)損害患者機(jī)能,且療程較長,臨床療效有所限制[5]。胃癌是一種復(fù)雜的疾病,針對單一靶點的靶向治療早已不能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的需求,而中藥正具有多靶點、多成分治療胃癌的特點,在延緩胃癌發(fā)展進(jìn)程、改善患者癥狀、延長生存時間、緩解術(shù)后副作用等方面都具有較大優(yōu)勢,現(xiàn)也是研究熱點之一[6-7]。

黃酮類化合物以2-苯基色原酮為基本骨架,存在于多種植物、中草藥中,具有低毒、安全、有多種藥理活性等優(yōu)點。有學(xué)者曾對黃酮類化合物進(jìn)行過研究,例如:香青蘭總黃酮可以降低胃癌中某特定細(xì)胞的增殖與遷移水平,抑制胃癌細(xì)胞侵襲人體,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡[8];異橙黃酮可以通過調(diào)控部分信號通路起到抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用[9];山柰酚可以阻礙胃癌G2期細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,是潛在治療胃癌的藥物成分[10],這說明部分黃酮類化合物對胃癌具有一定的治療作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在分子水平上分析藥物、靶點與疾病間復(fù)雜的互作關(guān)系,探索藥物治療疾病的作用機(jī)制[11]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)綜合研究黃酮類化合物治療胃癌的藥理作用機(jī)制,選取的六個黃酮類化合物均由云南民族大學(xué)教育部重點實驗室在多種植物中獲取,通過分析評估這些黃酮類化合物對胃癌的治療作用,為新型抗胃癌藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù),以期獲得具有治療胃癌可能性的藥物。

1 材料與方法

1.1 黃酮類化合物靶點的預(yù)測

利用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件繪制六個黃酮類化合物的平面結(jié)構(gòu),并導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫檢測相關(guān)藥理參數(shù),一般口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的藥物吸收較為良好,代謝緩慢,適合進(jìn)行藥物開發(fā)[12-13]。6個小分子具體信息如表1示。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)預(yù)測probability大于0的靶點,刪除重復(fù)項并整合,得到6個黃酮類小分子靶點。

表1 黃酮類化合物信息

1.2 胃癌疾病靶點的收集

通過人類基因綜合數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org/)以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞條檢索胃癌相關(guān)靶點。

1.3 獲取黃酮類小分子與胃癌交集靶點

利用Venn軟件獲取黃酮類小分子與胃癌的交集靶點,以韋恩(Venn)圖展示,這些交集靶點可能是黃酮類化合物治療胃癌的重要靶點。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為探究黃酮分子與胃癌的相互作用,在String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)中上傳交集靶點,設(shè)定研究物種為人,置信度為Highest(0.900),獲取初始PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)信息文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件,以度值(Degree)作為要素構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),并篩選黃酮分子治療胃癌的核心靶點。

1.5 化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape3.8.0軟件對化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化構(gòu)建,分析黃酮類化合物對胃癌疾病的相互作用。

1.6 GO功能富集及KEGG通路富集

利用R語言對交集靶點進(jìn)行GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析,以參數(shù)p<0.05為篩選條件,得到黃酮類化合物作用于胃癌的主要基因功能和通路并可視化富集分析結(jié)果。

1.7 分子對接驗證

通過富集分析結(jié)果找到黃酮類化合物治療胃癌最主要的通路,并查閱文獻(xiàn)找出與此通路相關(guān)的蛋白,利用PDB數(shù)據(jù)庫下載蛋白結(jié)構(gòu)并進(jìn)行預(yù)處理。利用AutoDock對接軟件將蛋白與6個黃酮類化合物進(jìn)行分子對接驗證其結(jié)合能力,將對接最好的結(jié)果利用Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 黃酮類化合物及胃癌的預(yù)測靶點

Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測6個黃酮類化合物的靶點共681個,去除重復(fù)項得到228個靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索共獲12 309個胃癌相關(guān)靶點。

2.2 黃酮類化合物與胃癌的交集靶點

利用Venn軟件得到交集靶點203個,這些即為黃酮類化合物治療胃癌的作用靶點,交集靶點韋恩圖見圖1。

圖1 交集靶點Venn圖

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)核心靶點

通過String數(shù)據(jù)庫得到初始PPI網(wǎng)絡(luò)圖,如圖2示。將PPI網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中,刪去游離節(jié)點,即得黃酮類化合物與胃癌交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖3示。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有186個節(jié)點,449條邊,蛋白平均度值為4.53。節(jié)點為靶點蛋白,邊表示蛋白間的相互作用,度值與節(jié)點大小、顏色深淺成正比。根據(jù)度值、介數(shù)中心性、接近中心性等參數(shù)篩選出10個核心靶點,靶點信息見表2。

圖2 初始PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 黃酮類化合物-胃癌PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 核心靶點及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)

2.4 化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò),見圖4。網(wǎng)絡(luò)中共有210個節(jié)點,6個紫色節(jié)點為黃酮類化合物,其余203個綠色節(jié)點屬于靶點,藍(lán)色節(jié)點為胃癌疾病,邊表示此化合物與靶點有作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中HT1、HT3、HT4和HT5度值較高,聯(lián)結(jié)的靶點較多,說明這些化合物可能具有抗胃癌的作用,是新型治療胃癌藥物的潛在有效活性成分。

圖4 化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 富集分析

利用R語言進(jìn)行GO基因功能富集分析與KEGG通路富集分析,篩選得到163條GO生物過程條目和156條KEGG信號通路。

分析富集結(jié)果發(fā)現(xiàn),本文所用的黃酮類化合物對胃癌作用的生物學(xué)過程主要涉及:蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、水解酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、碳氧裂解酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、SH2結(jié)構(gòu)域綁定等多種途徑,這說明了黃酮類化合物對胃癌的治療是一個復(fù)雜的多生物學(xué)過程。圖5列出靠前20個條目,圖中柱形區(qū)域越長,富集的基因越多,顏色越紅,p值越小,結(jié)果越顯著。本文所用的黃酮類化合物主要作用于:EGFR酪氨酸激酶抑制劑、PI3K-Akt信號通路、內(nèi)分泌抵抗、胰腺癌、Ras信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、麻疹、Rap1信號通路、卵巢類固醇生成等通路。這說明了本文選取的黃酮類化合物主要通過調(diào)控上述多類通路對胃癌進(jìn)行協(xié)同治療。圖6列出靠前20條信號通路,圖中柱形區(qū)域越長,富集的基因越多,顏色越紅,p值越小,結(jié)果越顯著。前20個GO條目信息見表3,通路信息見表4。

圖5 203個潛在靶點的GO富集分析

表3 GO富集分析表

圖6 203個潛在靶點的KEGG富集分析

表4 KEGG富集分析表

由圖7知,PI3K-Akt信號通路是靶點富集最多的通路,結(jié)果顯著,說明此通路是黃酮類分子作用于胃癌的相關(guān)重要通路之一。

圖7 PI3K-Akt信號通路圖

2.6 分子對接

通過文獻(xiàn)查閱,PI3K蛋白(PDB:1E7U)、ATP/PI3K復(fù)合物結(jié)構(gòu)(PDB:1E8X)是與PI3K-Akt信號通路相關(guān)的蛋白,下載其結(jié)構(gòu)并與六個黃酮小分子分別進(jìn)行分子對接,對接結(jié)果如表5所示。結(jié)合能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J),說明結(jié)合能力較好,結(jié)合能小于-7 kcal/mol,說明結(jié)合構(gòu)型有強(qiáng)烈的活性。所得對接結(jié)果都小于-7 kcal/mol,說明六個黃酮類化合物與PI3K-Akt通路相關(guān)蛋白對接情況較好,驗證了上述所得結(jié)果。將結(jié)合能最小的結(jié)果進(jìn)行可視化,如圖8所示。

表5 1E7U、1E8X分子對接結(jié)果

圖8 1E7U與HT4(左)、1E8X與HT3(右)分子對接圖

3 討 論

通過對PPI網(wǎng)絡(luò)的分析,得到了網(wǎng)絡(luò)中較大、顏色較深、處于網(wǎng)絡(luò)中心位置的核心靶點,說明黃酮類化合物抗胃癌很可能就是通過干預(yù)核心靶蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些核心靶點與胃癌高度相關(guān),有研究表明,SRC是一種非受體酪氨酸激酶,也是原癌基因,通過廣泛的信號傳導(dǎo)參與幽門螺旋桿菌感染,而此感染是引發(fā)胃癌的關(guān)鍵因素。SRC在胃癌病變組織中高度活化,表達(dá)異常,與胃癌的發(fā)展等過程高度相關(guān)[14];調(diào)控表皮生長因子(EGFR)可以修復(fù)胃黏膜、增加機(jī)體對胃酸和胃蛋白酶的耐受,其異常表達(dá)也與胃癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)[15];血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)能誘導(dǎo)胃癌血管的生成,給予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移動力,阻礙癌細(xì)胞的凋亡[16];PIK3CA與PIK3R1在胃癌中的突變率都很高[17],其中磷酸肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1(PIK3R1)是一種腫瘤抑制因子,在癌癥中低表達(dá),其下調(diào)對癌癥患者有害,能激活PI3K-Akt通路進(jìn)而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對藥物的耐受度[18];信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)在胃癌中也處于異常狀態(tài),抑制其傳導(dǎo)與表達(dá)可降低胃癌致瘤性[19]。

KEGG富集分析得到的通路涵蓋癌癥、炎癥、病毒等多個方面,對與胃癌相關(guān)的部分通路進(jìn)行說明。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路(PI3K-Akt)能參與細(xì)胞代謝等多種過程,幾乎可被所有細(xì)胞和病毒刺激,是很重要的通路。PI3K-Akt通路是治療胃癌的主要分子通路[20]。涂江江等[21]通過實驗驗證了PI3K-Akt通路被異常激活后在胃癌干細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量比普通腫瘤細(xì)胞高。被異常激活的PI3K-Akt通路在胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移中存在高度活化與表達(dá)過量的現(xiàn)象,會促進(jìn)胃癌的發(fā)展進(jìn)程[22]。因此通過靶向調(diào)控此通路,可以抑制胃癌腫瘤細(xì)胞的生長與增殖,誘導(dǎo)其凋亡,還能抑制胃癌細(xì)胞前期發(fā)展過程中的病變[23];EGFR酪氨酸激酶抑制劑能抑制EGFR激酶區(qū)磷酸化,阻礙相關(guān)信號傳導(dǎo),從而發(fā)揮抗腫瘤療效,在晚期胃癌患者的治療中也有成效[24-25];據(jù)統(tǒng)計,在大于三分之一的胃癌病例中,Ras信號通路會被異常激活;此外,胃癌的轉(zhuǎn)移也會造成多種代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化等不良反應(yīng),還可能產(chǎn)生如動脈粥樣硬化、胰腺癌等多種并發(fā)疾病,這些疾病與腫瘤顯著相關(guān)[26];內(nèi)分泌抵抗通路與Rap1通路常與促進(jìn)胃癌耐藥相關(guān);胃癌中還存在與麻疹相關(guān)的基因,麻疹病毒疫苗對腫瘤具有殺傷性,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[27]。因此推測這些通路是參與胃癌發(fā)病進(jìn)程的重要通路,可能是通過抑制胃癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡等達(dá)到治療胃癌的目的。

綜上所述,本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了實驗室獲取的6個黃酮類化合物治療胃癌的作用機(jī)制,說明其具有多靶點、多通路、多途徑治療胃癌的特點,研究這些靶點與通路和胃癌的關(guān)系可以加深對胃癌的認(rèn)識,有重要的意義,為抗胃癌新藥的研發(fā)及實驗提供參考思路與科學(xué)依據(jù)。