王 萌, 張康成, 范希峰, 滕文軍, 溫海峰, 張 輝, 高 康, 滕 珂, 武菊英, 岳躍森*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100097； 2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京 102206)

苔草屬(CarexL.)是莎草科(Cyperaceae)多年生草本植物，其種類繁多，全球約2 000種以上，廣泛分布于世界各地，是莎草科中的最大屬之一，僅次于大戟屬和胡椒屬。中國苔草屬植物達(dá)500 種以上，在我國分布范圍較廣，內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、河南、山東、陜西、江蘇、四川、浙江、臺灣等地均有分布[1-3]。

苔草屬植物不僅具有春季返青早、根莖發(fā)達(dá)、綠期長、形態(tài)優(yōu)美的特點(diǎn)，而且均有耐旱和維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)，既可以作為優(yōu)良的林下或建筑物背蔭處地被植物，也可以作為觀賞草與其他植物配置應(yīng)用[3]。在北方地區(qū)的園林綠化中作為地被應(yīng)用的苔草主要有澇峪苔草(Carexgiraldiana)、青綠苔草(Carexbreviculmis)等[4]。當(dāng)前對于青綠苔草的研究主要側(cè)重于應(yīng)用方向。楊學(xué)軍等[5]發(fā)現(xiàn)低濃度的赤霉素處理和濃硫酸處理30 s均可以有效提高青綠苔草種子發(fā)芽率；溫海峰等[6]研究青綠苔草混播技術(shù)，發(fā)現(xiàn)青綠苔草和冷季型草坪草混播后，播種量是5 g·m-2時(shí)其株高較高，且同樣播種量和多年生黑麥草(LoliumperenneL.)混播后青綠苔草自身根長優(yōu)勢明顯；以及在光合特性[7]、抗旱性[8]、蒸散特性[9]、抗寒性[10]等植物生理方面也有相關(guān)研究。然而，有關(guān)青綠苔草育種方面的研究鮮有報(bào)道。

誘變育種是一種在不改變優(yōu)良品種遺傳背景情況下，改善品種性狀的有效策略[11]。在19世紀(jì)末，放射性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)對于誘變育種研究進(jìn)程具有極大地促進(jìn)作用，果蠅輻射試驗(yàn)以及20世紀(jì)40年代開始的化學(xué)誘變劑的使用，是如今誘變育種常用的兩種方法[12]。其中，物理誘變包括電離狀態(tài)下的輻射和非電離狀態(tài)下的輻射兩種形式。電離狀態(tài)下的輻射如X、γ、β射線以及由夸克組成的中子等，非電離輻射如激光照射和紫外線輻照等方式[13]。1928年Stadler[14]首次將X射線應(yīng)用到玉米和小麥上，成功誘導(dǎo)了小麥產(chǎn)生了突變體，開啟了輻射誘變的新育種領(lǐng)域。我國植物輻射誘變育種工作起步較晚，主要研究γ射線和中子。其中60Co-γ射線穿透力強(qiáng)，變異譜大，誘導(dǎo)的變異性狀可在當(dāng)代進(jìn)行篩選，目前作為一種便捷的育種方法被廣泛應(yīng)用于多種植物中[15]，在花卉[15-16]、果樹[17]以及農(nóng)作物[18-19]等方面都取得了一系列的成果。孫音等[15]對兜蘭組培苗進(jìn)行了60Co-γ射線輻射，得到了變異性狀明顯且效果穩(wěn)定的植株；胡鐘東等[20]用輻射誘變清香梨的休眠枝，獲得了大果型突變株系；劉建鳳等[19]對小麥揚(yáng)輻麥4號經(jīng)過輻射誘變，得到了優(yōu)良的突變體新種質(zhì)資源，為培育小麥新品種奠定了基礎(chǔ)。

目前，尚無輻射誘變技術(shù)在青綠苔草育種中應(yīng)用的報(bào)道。本研究采用不同輻射劑量的60Co-γ射線對青綠苔草種子進(jìn)行誘變處理，通過研究不同輻射劑量對青綠苔草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，探討青綠苔草種子適宜60Co-γ射線輻射劑量，為今后利用60Co-γ射線輻射誘變技術(shù)提高青綠苔草遺傳多樣性、創(chuàng)造新種質(zhì)、培育優(yōu)良新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的青綠苔草種子來自北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，于2021年4月份采收，試驗(yàn)前將種子通風(fēng)干燥處理后放入自封袋中并冷藏保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子輻射 處理將青綠苔草的干種子包裝于自封袋中，在中國計(jì)量科學(xué)研究院輻射中心進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理。查閱整理相關(guān)文獻(xiàn)后準(zhǔn)備進(jìn)行7個梯度的輻射處理，輻射劑量分別為0(對照)，75，100，150，250，450和650 Gy，輻射劑量率為1 Gy·min-1。每個處理3次重復(fù)。

1.2.2種子消毒 選取適量青綠苔草種子，先使用5%次氯酸鈉溶液消毒20 min后，用蒸餾水清洗青綠苔草種子3～5遍，再加入蒸餾水于離心管中浸種24 h后進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.2.3種子發(fā)芽試驗(yàn) 在每一個培養(yǎng)皿內(nèi)鋪設(shè)3張濾紙，用蒸餾水浸透，整齊放入50粒處理好的青綠苔草種子，每個輻射處理重復(fù)3次。將所有培養(yǎng)皿放入到人工氣候培養(yǎng)箱(10 h黑暗/14 h光照，25℃/23℃)中。從第2日開始每日記錄種子的發(fā)芽情況，并且及時(shí)給種子補(bǔ)充蒸餾水，防止種子缺水，總共觀察記錄18天，以青綠苔草種子胚根突破其種皮且長度與種子等長為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4成苗率試驗(yàn) 將消毒處理后的青綠苔草種子均勻播種到穴盤中，穴盤中每穴1粒種子，每一個處理播種50粒，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，置于溫室培養(yǎng)。青綠苔草種子在7 d后開始記錄出苗情況，總共觀察記錄25天后進(jìn)行成苗率測定。

1.2.5種子生長 指標(biāo)的測定發(fā)芽試驗(yàn)進(jìn)行18天，每日記錄發(fā)芽數(shù)據(jù)，計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(計(jì)算公式如下)，隨機(jī)選擇5株長勢良好的青綠苔草幼苗，分別測量其根長、苗高和鮮重。取每個指標(biāo)的平均值進(jìn)行方差分析。

種子活力指數(shù)VI=S×GI

公式中：Gt表示在第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dm表示對應(yīng)青綠苔草種子發(fā)芽所處的天數(shù)，總共18天發(fā)芽數(shù)據(jù)。S表示種苗生長勢情況(鮮重或者長度大小)。

1.2.6半致死劑量 為了確定適宜輻射劑量，根據(jù)周小梅等[21]的方法計(jì)算出青綠苔草種子的半致死劑量。根據(jù)青綠苔草種子不同輻射劑量下的相對出苗率建立y=a+bx的擬合線性回歸方程，輻射劑量和青綠苔草種子的相對成苗率值分別作為自變量和因變量，研究采用青綠苔草種子的成苗率為50%時(shí)來確定其半致死劑量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和圖表的制作。使用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)分析，LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ輻射劑量對青綠苔草種子萌發(fā)的影響

表1可知，不同60Co-γ輻射劑量對青綠苔草種子萌發(fā)產(chǎn)生不同的影響。未經(jīng)輻射處理的對照種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)最高，分別為89.3%，56.0%，43.7% 和82.6%，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，青綠苔草種子發(fā)芽相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)均逐漸降低，輻射處理對青綠苔草的種子萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用。在發(fā)芽率中，除75 Gy和100 Gy發(fā)芽率和0 Gy相比差異不顯著外，其輻射處理都與對照相比差異顯著(P<0.05)。其中，輻射劑量為450 Gy至650 Gy時(shí)，發(fā)芽率下降最明顯，與對照相比減少了48.5%，青綠苔草種子發(fā)芽受到強(qiáng)烈的抑制作用。在發(fā)芽勢隨輻射劑量增加而逐漸減小的過程中，各輻射劑量處理后的發(fā)芽勢都和對照組有顯著差異(P<0.05)，且0至75 Gy時(shí)，發(fā)芽勢的下降最為明顯。從發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)下降過程中，每一個梯度處理后數(shù)值均與對照組差異顯著。此外，在輻射劑量為450 Gy和650 Gy時(shí)，活力指數(shù)為0，青綠苔草種子已經(jīng)喪失活力，抑制作用最明顯。

表1 不同60Co-γ射線輻射劑量對青綠苔草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different radiation doses of 60Co-γ on seed germination of Carex leucochlora

2.2 不同60Co-γ輻射劑量對青綠苔草成苗率的影響

表2可知，不同60Co-γ輻射劑量處理對青綠苔草成苗率的影響差別明顯，隨著輻射劑量的增加，青綠苔草種子的成苗率顯著下降。其中，輻射劑量為75 Gy，青綠苔草成苗率最高；輻射劑量為75 Gy至100 Gy時(shí)，成苗率下降最明顯，與對照相比減少了61.3%。當(dāng)輻照強(qiáng)度為450 Gy和650 Gy時(shí)，其達(dá)到或超過其致死劑量的限度，青綠苔草成苗率為0。圖1表明，輻射對青綠苔草成苗率的影響與輻射劑量呈負(fù)相關(guān)(R2=0.6601)。

表2 60Co-γ射線不同輻射劑量處理對青綠苔草種子成苗率和幼苗生長的影響Table 2 Effects of different radiation doses of 60Co-γ on seedling rate and growth of Carex leucochlora

圖1 不同輻射劑量處理下青綠苔草實(shí)際成苗率Fig.1 Seedling rate of Carex leucochlora under different radiation doses

2.3 不同60Co-γ輻射劑量對青綠苔草幼苗生長的影響

表2可知，青綠苔草幼苗的根長、苗高和鮮重值均隨著60Co-γ輻射劑量增加而逐漸減少，顯示出60Co-γ輻射抑制青綠苔草幼苗生長。未經(jīng)輻射處理，青綠苔草幼苗的根長、苗高和鮮重分別為2.66 cm、1.89 cm和4.1 mg，均處于最高。輻射處理(75 Gy至650 Gy)后，青綠苔草幼苗的根長和苗高鮮重均顯著下降，然而鮮重下降差異不顯著。當(dāng)輻射劑量為250 Gy時(shí)，根長與苗高較對照減少幅度已經(jīng)達(dá)到62.4%和63.0%，青綠苔草的生長已經(jīng)嚴(yán)重受抑制。

2.4 青綠苔草種子半致死劑量的確定

研究采用相成苗率的數(shù)據(jù)計(jì)算出相對成苗率的擬合線性回歸方程(圖2)，從而確定出青綠苔草種子的半致死劑量。青綠苔草種子的相對出苗率與其輻射劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，得出相對成苗率的擬合線性回歸方程為y=80.832-0.2236x(R2=0.6708)，其中輻射劑量為自變量x，青綠苔草種子的相對出苗率為因變量y。本實(shí)驗(yàn)將50%時(shí)的種子相對出苗率作為確定半致死劑量的指標(biāo)，代入到上述擬合線性回歸方程中得到青綠苔草種子的理論半致死劑量約為138 Gy。

圖2 不同輻射劑量處理下青綠苔草種子的相對成苗率Fig.2 Relative seedling rate of Carex leucochlora under different radiation doses

3 討論

輻射所導(dǎo)致的種子萌發(fā)相關(guān)各指標(biāo)包括種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等的下降可能與輻射造成的種胚組織受損，對細(xì)胞生長和分裂的抑制，以及萌發(fā)過程種子的生理活動影響有關(guān)[22]。萌發(fā)率的測定目前被認(rèn)為是衡量不同種子誘變效果簡便可靠的方法,隨著輻射劑量的增加幼苗生長顯著下降[23]。研究表明，煙草[24]、薏苡[25]和小麥[26]等植物種子被60Co-γ射線高劑量輻射后生長均會受到抑制。本研究采用不同輻射劑量(0，75，100，150，250，450和650 Gy)的60Co-γ射線對青綠苔草種子進(jìn)行誘變處理，結(jié)果表明隨著輻射劑量的增加，青綠苔草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率等均逐漸降低，青綠苔草幼苗的苗高與根長的生長受到抑制逐漸明顯，直至不能生長。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。

然而，有研究發(fā)現(xiàn)低劑量的60CO-γ照射后對植物有一定促進(jìn)作用[27-28]。王文恩等[29]對狗牙根(CynodondactylonL.)種子輻射效應(yīng)的研究也發(fā)現(xiàn)相似現(xiàn)象，200至350 Gy低劑量的60CO-γ輻射對狗牙根幼苗的生長有一定的促進(jìn)作用。這可能與輻射引起種子內(nèi)部生物自由基或有關(guān)酶的活性變化有關(guān)，從而提高了種子的新陳代謝水平，促進(jìn)了種子的萌發(fā)。但是，過高的輻射劑量能夠種子胚受損，酶活性完全受到抑制或喪失，使細(xì)胞無法進(jìn)行正常的分裂活動，從而影響了種子的正常萌發(fā)與生長。從本研究的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，輻射劑量為250 Gy時(shí)，青綠苔草的萌發(fā)率為68%，成苗率僅為3.3%；而輻射劑量為450 Gy時(shí)，青綠苔草種子的發(fā)芽率仍然有47.3%，但是其成苗率為零。這與周小梅等[21]對冷季型草坪草匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)、高羊茅(Festucaelata)、多年生黑麥草等輻射效應(yīng)研究的結(jié)果一致。

通常低劑量輻射對種子損傷較小，其對非目標(biāo)性狀影響也相對較少,而高劑量輻射能引起較大范圍的變異，但其對種子生理損傷加劇，種子成活率顯著下降。因此，在采用輻射誘變方法進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育的過程中選擇適宜的輻射劑量是一個關(guān)鍵的因素。通常將植株成活率為50%時(shí)的輻射劑量即半致死劑量作為適宜的輻照劑量[30]。本研究通過種子相對成苗率的擬合線性回歸方程計(jì)算得出青綠苔草種子的理論半致死劑量約為138 Gy，從而確定了青綠苔草種子適宜輻射劑量。余蓉培等[31]研究發(fā)現(xiàn)波士頓蕨(Nephralepisexaltata)的綠色球狀體在不同輻射劑量的60Co-γ射線處理下，最適宜的輻射劑量為128 Gy?？梢?，不同的試驗(yàn)材料最終的半致死劑量是不同的。尹淑霞等[32]研究發(fā)現(xiàn)黑麥草(Loliumperenne)種子經(jīng)60CO-γ射線照射處理后，試驗(yàn)中發(fā)芽率等所測指標(biāo)同樣顯示出種子隨輻射劑量增加，抑制作用變強(qiáng)，并且引起了酶指標(biāo)的變化。趙靜等[33]研究紫薇(Lagerstroemiaindica)種子的輻射效應(yīng)，同樣發(fā)現(xiàn)處理后輻射造成顯著抑制性。這都與本次青綠苔草輻射試驗(yàn)結(jié)果基本一致，都是種子萌發(fā)和幼苗的生長指標(biāo)與輻射的劑量大小呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

本次研究誘變對于青綠苔草種子的影響還只是初步探討，只是測定了發(fā)芽試驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)，還可以對輻射后的材料進(jìn)行染色體的鑒定、光合速率、蒸騰速率以及各項(xiàng)酶的指標(biāo)的測定，以便于對輻射后的青綠苔草進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

青綠苔草種子在不同輻射劑量的60Co-γ射線處理下的萌發(fā)與生長存在較大差異，青綠苔草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率等萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)和苗高、根長等生長指標(biāo)均隨著輻射劑量的增加而逐漸降低；根據(jù)種子的相對成苗率，初步確定青綠苔草種子的適宜輻射劑量(半致死劑量)約為138 Gy。本研究為今后利用60Co-γ射線輻射誘變技術(shù)提高青綠苔草遺傳多樣性、創(chuàng)造新種質(zhì)、培育優(yōu)良新品種提供了理論依據(jù)。