耿依儀， 于 露， 張萬通， 周華坤， 鄧艷芳， 康海燕， 冶文哥， 邵新慶*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100193； 2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室，青海 西寧 810001； 3.祁連山國家公園青海服務(wù)保障中心， 青海 西寧 810001; 4.青海省海北州祁連縣峨堡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，青海 海北 810400； 5.青海省海北州祁連縣野牛溝林場邊麻管護(hù)站， 青海 海北 810499)

近年來，過度放牧、全球變暖等外界因素導(dǎo)致青藏高原地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)極度脆弱，草地資源嚴(yán)重退化，蟲鼠災(zāi)害頻發(fā)[1]。其中蝗蟲作為影響牧場和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要害蟲之一，對青藏高原地區(qū)的損害難以忽視[2]。因此，采取有效的措施來防范和治理蝗蟲泛濫給青藏高原帶來的危害成為了該地區(qū)退化草地修復(fù)和管理工作的重中之重[3]。目前最為廣泛措施仍是化學(xué)防治和機械防治，但由于人力物力投資成本較多、防治效果較弱，以及無節(jié)制的化學(xué)農(nóng)藥施用導(dǎo)致有害生物抗性、再猖獗和農(nóng)藥殘留[4]，進(jìn)一步促使人們開始聚焦于“環(huán)境友好型”的生物防治。為保證綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境安全，利用微生物菌肥作為一種農(nóng)藥替代途徑的生物防治技術(shù)逐漸成為研究熱點[4]。

作為地球上較為古老的微生物，叢枝菌根真菌(Arbusculae mycorrhizal fungi,AMF)最先與陸生植物共生的菌群，在土壤中分布較廣[5]。與絕大多數(shù)陸生植物的根系形成共生體后，AMF可以提高植物對養(yǎng)分的吸收能力，增強宿主植物對逆境的適應(yīng)[6-7]。真菌通過根外菌絲幫助植物接觸并獲取土壤中活動性弱、遷移較緩的元素，以滿足生長繁殖的需求。作為交換，宿主植物為AMF提供以脂肪酸和糖類物質(zhì)為主要形式的碳水化合物，從而達(dá)到“真菌-植物”互利互惠的目的[4]。

AMF具有增強宿主植物對生物和非生物因素脅迫的抗性[8]。相關(guān)研究表明，4種不同AM真菌(球狀巨孢囊霉,Gigasporamargarita;幼套球囊霉,Glomusetunicatum;根內(nèi)球囊霉,Glomusintraradices;稍長無梗囊霉,Acaulosporalongula.)均誘導(dǎo)日本百脈根(Lotusjaponicus)酚類含量增加，抑制了二斑葉螨(Tetranychusurticae)的生長繁殖[9]；2種AM真菌(摩西球囊霉,Glomusmosseae;根內(nèi)球囊霉,Glomusintraradices)均通過誘導(dǎo)銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)體內(nèi)產(chǎn)生更多的次生代謝物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)植物防御反應(yīng)[10]。異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)通過激活番茄(Solanumlycopersicum)體內(nèi)的JA途徑來降低棉貪夜蛾(Spodopteralittoralis)的生存率[11]。AM真菌(Glomusmosseae)能夠明顯增強垂穗披堿草對低溫脅迫的耐受性的同時[12]，還可顯著促進(jìn)其對有機氮吸收，進(jìn)一步提高牧草品質(zhì)和產(chǎn)量[13]。由于AMF的非特異性將同種和異種植物個體根系相連接后，與其他植株的菌根菌絲相互接觸后形成菌絲網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Common mycelial network,CMN)[14]，從而為防御性物質(zhì)的傳遞搭建了防御通路[8]。菌絲直徑較細(xì)，能夠延伸并接觸到植物根系無法達(dá)到的土壤區(qū)域，拓寬植物吸收額外養(yǎng)分的面積，促進(jìn)其營養(yǎng)吸收[15]。

垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb) 作為青藏高原地區(qū)的優(yōu)良牧草，屬疏叢型的禾本科牧草，抗寒耐寒性強，營養(yǎng)豐富、適口性好、產(chǎn)量高和耐貧瘠等優(yōu)點[1,3,16]，還可防風(fēng)固沙、保持水土并加速草地生態(tài)恢復(fù)進(jìn)程[17]，有效降低自然災(zāi)害帶來的經(jīng)濟損失。老芒麥(ElymussibiricusLinn.)具備高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗旱耐寒和較強的適應(yīng)性等較為優(yōu)良特性，已經(jīng)逐漸成為青藏高原地區(qū)的主要栽培草種之一[18]。

目前國內(nèi)外研究多聚焦在叢枝菌根真菌對植物的抗寒抗旱等抗逆性方面[5,14-15]，但對于AM真菌-草本植物共生情況下如何防御蟲害損傷這一領(lǐng)域仍存在局限性。本研究擬以垂穗披堿草和老芒麥為研究對象，通過室內(nèi)盆栽試驗開展AMF在披堿草屬植物間協(xié)同抗蟲防御機制研究，以分析AMF對兩種草本植物的生長發(fā)育及化學(xué)防御的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料準(zhǔn)備

1.1.1基質(zhì)處理 試驗基質(zhì)土壤取自青海省海北藏族自治州青藏高原高寒草甸，將其過2 mm篩，移除較大石塊后，用高溫高壓蒸汽滅菌鍋濕熱以消除土壤中的真菌孢子(121℃，2 h)。試驗土壤基本理化性質(zhì)如下：土壤pH值為8.2，總氮含量為4.1 g·kg-1，總碳含量為40 g·kg-1，總磷含量為0.69 g·kg-1。

1.1.2牧草種子 垂穗披堿草和老芒麥種子收集于青海省海北藏族自治州海晏縣西海鎮(zhèn)的天然高寒草甸。選取健康、無病蟲害的垂穗披堿草和老芒麥種子，用8%的過氧化氫溶液消毒10 min后用無菌水沖洗三次后置于培養(yǎng)箱中催芽[19]。

1.1.3供試?yán)ハx 供試?yán)ハx東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis，F(xiàn)m)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系害蟲生防室提供。試驗前將蝗蟲置于25℃的培養(yǎng)室(溫度為28℃～30℃，濕度為65%～70 %，光照條件為16 h/8 h (白天/黑夜)中進(jìn)行培養(yǎng)，每天早晚以新鮮的小麥葉片進(jìn)行飼喂至五齡待用。

1.1.4供試菌種 供試菌種為叢枝菌根真菌摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)，來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院，由貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)院擴繁。接種劑中含有真菌孢子、菌根侵染根段，且孢子個數(shù)約為129個·g-1。

1.2 試驗設(shè)計

本研究試驗裝置如下圖1所示，共設(shè)置5組處理，分別為處理A：供體與受體植物間放置35 μm尼龍網(wǎng)；處理B：供體與受體間用0.5 μm尼龍網(wǎng)阻隔；處理C：供體與受體間用35 μm尼龍網(wǎng)阻隔，蟲咬前旋轉(zhuǎn)；處理D：供體與受體間無任何尼龍網(wǎng)阻隔；處理E：供體與受體間無任何阻隔(除E組外，其余各組處理供體植物均接種AMF)，具體處理如表1所示。待種子發(fā)芽長度至2 cm左右時，將長勢一致的垂穗披堿草和老芒麥種苗分別移栽至盛有2.5 kg滅菌過的土壤基質(zhì)的方形花盆中(長20 cm×寬12 cm×高15 cm)。待移苗30天后，進(jìn)行接種處理，其中Fm菌土20 g(對照組為已滅菌過的Fm菌土20 g)。垂穗披堿草的種苗移栽至花盆左側(cè)作為供體，并對其接菌，老芒麥的種苗移栽至花盆右側(cè)作為受體。每個花盆內(nèi)維持供體和受體植株分別50株。將所有花盆隨機放置于溫室(溫度為25℃～28℃，濕度為(25±3)%，光照條件為12 h∶12 h (白天∶黑夜))內(nèi)培養(yǎng)。

表1 實驗分組、處理與目的Table1 Experimental groups,treatments and aims

圖1 試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental device

每隔3天隨機調(diào)整花盆擺放位置。同時為避免植物在被昆蟲采食后所釋放的揮發(fā)性物質(zhì)給實驗結(jié)果帶來的影響，選用聚乙烯袋(110 cm×111 cm，高溫高強光下?lián)]發(fā)物釋放量較低)將供受體植物的地上部分分別嚴(yán)密包裹。

1.2.1蟲咬處理 待接菌后30天，在左側(cè)供體室釋放5只五齡蝗蟲進(jìn)行24 h的采食實驗。昆蟲采食前進(jìn)行饑餓處理2 h。

1.3 測定方法

1.3.1AMF菌絲定殖率的測定 收獲垂穗披堿草和老芒麥的根系各1.0 g，并將其剪成1～2 cm長的根段，將根段浸沒在10%KOH溶液中沸水浴 30 min后，用蒸餾水沖洗，置于2%的HCI中浸泡20 min。去除HCI后用蒸餾水沖洗后，用0.05%的臺盼藍(lán)染液在80℃水浴條件下染色20 min。待染色結(jié)束后去除染液，用蒸餾水沖洗干凈后置于50%脫色液中甘油∶水=1∶1)脫色。脫色1～2 d后隨機挑選根段制作樣品片，每個載玻片共壓制15個根段，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在40X顯微鏡下觀察AMF定殖情況[8]。

1.3.2植物地上、地下生物量和碳氮磷含量的測定 將植物地上和地下部分分別收集后，于65℃條件下烘干72 h至恒重后，稱量其干重[16]。用球磨儀(德國，Retsch MM400)將植物樣品粉碎，取0.1 g樣品用元素分析儀(德國，Elementar Vario MICRO CUBE)測定植株全氮、全碳[20]。

1.3.3防御酶活性的測定 待蝗蟲采食葉片24 h后，收集植物葉片進(jìn)行防御性酶活測定。分別采用北京索萊寶科技有限公司的植物多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnine ammonia-lyase,PAL)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase)活性檢測試劑盒測定多酚氧化酶(PPO)、脂氧合酶(LOX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase)活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

用SPSS軟件對AMF定殖率、植物碳氮磷含量、四種防御酶等數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Pearson’s analysis進(jìn)行植物各指標(biāo)間的相關(guān)分析，顯著水平為0.05。用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根定殖率和地上地下生物量

各處理下的供體植物的菌根定殖率無顯著差異(圖2)，處于10.26%～19.44%；由于A處理設(shè)有0.5 μm尼龍網(wǎng)，導(dǎo)致受體植物菌根定殖率大大減少，為1.14%，與各處理組的菌根定殖率有顯著差異(P<0.05)。

圖2 不同處理下供體和受體菌根定殖率情況Fig.2 AMF colonization of donor and receiver plants under different treatments注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，n=3，下同Note:Mean±SE. Different lowercases letters indicate significant difference at the 0.05 level,n=3,the same as below

各處理的地上生物量無顯著差異(圖3a)。未接菌的E組下供受體植物的地下生物量均較少，分別為1.88 g和2.39 g；AMF接種處理中，A，C處理下供受體植物的生物量相對較多；其中C處理下的供受體植物的地下生物量最高，分別為3.44 g和0.92 g。

圖3 不同處理下供體和受體地上(a)和地下生物量(b)變化情況Fig.3 Aboveground and belowground biomass of donor and receiver plants under different treatments注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，n=3，下同Note:Mean±SE. Different lowercases letters indicate significant difference at the 0.05 level,n=3,the same as below

2.2 植物碳、氮含量情況

E組供、受體植物的總碳含量分別為40.21%，40.18%，均略高于其他各組(圖4a)；AMF接種處理下的C，D兩組的供、受體植物的總碳含量均無顯著差異。

圖4 不同處理下供體和受體葉片碳氮含量變化情況Fig.4 Leaf carbon and nitrogen content of donor and receiver plants under different treatments注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，n=3，下同Note:Mean±SE. Different lowercases letters indicate significant difference at the 0.05 level,n=3,the same as below

不同處理下供、受體植物的總氮含量差異較大(圖4b)。對于受體植物，E組總氮含量最高為1.56%；其次是B，C兩組，且B組略高于C組，但無顯著差異；A，D兩組受體植物總氮含量最低且無顯著差異。對于供體植物，D組總氮含量最高為1.38%；E組次之；B組總氮含量最低，為0.74%；A，C兩組總氮含量無顯著差異。

2.3 防御酶活性

由圖5可知，菌絲網(wǎng)絡(luò)是否存在對受體植物防御酶活性高低有重要影響。供體植物的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均顯著高于未接種AMF真菌的E組。有菌絲網(wǎng)絡(luò)存在的D組供受體植物的多酚氧化酶(PPO)活最高，分別是609.06 U· g-1FW和405.75 U·g-1FW；E組未接種AMF真菌，PPO酶活最低。

圖5 不同處理下防御性酶活性變化Fig.5 The changes of defenses enzymes in donor and receiver plants under different treatments注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，n=3，下同Note:Mean±SE. Different lowercases letters indicate significant difference at the 0.05 level,n=3,the same as below

2.4 菌根定殖下供體和受體植物各指標(biāo)間的相關(guān)分析

對于供體植物而言(表2)，地上生物量和地下生物量呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)；脂氧合酶與地下生物量、地下生物量呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。對于受體植物而言(表3)，地上生物量和地下生物量呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)；苯丙氨酸解氨酶與地上生物量和地下生物量呈極顯著正相關(guān)性(P<0.01)；植物碳含量與菌根定殖率、脂氧合酶呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與植物總氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.01)。

表2 供體植物各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between indicators of donor plants

表3 受體植物各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation between each indicator of receiver plants

3 討論

3.1 AMF真菌對宿主植物體營養(yǎng)吸收的影響

3.2 AMF真菌對宿主植物體內(nèi)防御酶活性的影響

AMF不僅可以提高植物對養(yǎng)分和水分的利用效率，而且可以提高植物對非生物和生物環(huán)境脅迫的抵抗能力。當(dāng)植物體遭遇逆境脅迫時，在自身進(jìn)行防御反應(yīng)的同時也會向外界釋放出一系列的化學(xué)信號來提醒周圍環(huán)境中的其他植物提前做好抵御逆境的準(zhǔn)備[28-29]。水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)作為參與植物抵抗生物脅迫的兩種關(guān)鍵信號物質(zhì)，在植物免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用[28]。多酚氧化酶、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、脂氧合酶(LOX)、β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase)等酶直接參與植物防御保護(hù)相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的生成過程，其酶活性的升高與宿主植物的防御抗性密不可分[30-31]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)作為植物體苯丙烷類代謝的起始酶，與多酚氧化酶(PPO)均是合成SA過程的重要關(guān)鍵酶；脂氧合酶，β-1,3-葡聚糖酶則涉及SA和JA防御途徑[32]。相較于未接菌處理，接種AMF的供體植物體內(nèi)的PPO，LOX，PAL和β-1,3-葡聚糖酶活性顯著上升，主要在于AM真菌能夠誘導(dǎo)植物脂氧合酶基因表達(dá)，啟動JA途徑、苯丙烷類代謝途徑[33-35]，說明AMF誘導(dǎo)并增強植物系統(tǒng)防御反應(yīng)。對于受體植物而言，菌絲網(wǎng)絡(luò)傳遞了信號物質(zhì)，使得受體植物體內(nèi)酶活性均上升，且程度不同，說明菌絲網(wǎng)絡(luò)的存在可以加快防御信號的傳遞，使植物體更快速地做出防御反應(yīng)。而不同植物間的差異，使得宿主植物對脅迫的響應(yīng)有所不同。此外，我們發(fā)現(xiàn)除了PAL和β-1,3-葡聚糖酶外，B，C處理組受體植物的酶活性高于無菌絲連接組，主要因為菌絲網(wǎng)絡(luò)被破壞或阻隔后，植物間信號傳遞受阻，難以為鄰近植物傳輸防御信號物質(zhì)，這體現(xiàn)了菌絲網(wǎng)絡(luò)作為植物信號傳遞的途徑的重要性。

4 結(jié)論

叢枝菌根真菌不僅能夠有效提高植物防御能力，與植物共生后形成的菌絲網(wǎng)絡(luò)還可促進(jìn)鄰近植物生長及傳遞防御信號物質(zhì)。綜合來看，叢枝菌根真菌能夠有效提高青藏高原地區(qū)垂穗披堿草的保護(hù)和生產(chǎn)。作為主要的生物防治手段，叢枝菌根真菌在替代化學(xué)農(nóng)藥的使用方面具有一定的潛力。