蔡丹磊 倪凱華 韓毓 黃中偉 董巖松

WHO將支氣管哮喘定義為四大頑疾之一，也是現(xiàn)今全球公認(rèn)的健康問題。由于支氣管哮喘患病較高，加之該疾病的臨床癥狀也十分典型，對患者的生活質(zhì)量影響較大[1]。支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，既往的研究表明，該疾病的發(fā)生與多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與息息相關(guān)，其臨床表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、可逆性氣流受阻及氣道炎癥細(xì)胞浸潤[2]。輔助性T細(xì)胞1（Th1）、輔助性T細(xì)胞2（Th2）、輔助性T細(xì)胞17（Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等CD4+T細(xì)胞在支氣管哮喘中的發(fā)病作用已有較多的學(xué)者進行報道研究[3-5]，但是由于支氣管哮喘的發(fā)病機制較為復(fù)雜，用各個細(xì)胞的比例失衡并不能很好地解釋。國外的兩位學(xué)者幾乎同時報道了一種定位于淋巴濾泡、具有輔助B細(xì)胞功能、表型為CXCR5+CD40L+ICOS+T細(xì)胞亞群，稱為濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）[6-7]。與既往的研究不同，該學(xué)者認(rèn)為Tfh細(xì)胞是不同于Th1、Th2、Treg、Th17的一個新的T細(xì)胞亞群。而目前尚無哮喘中Tfh細(xì)胞的作用及機制方面的研究報道?；诖耍敬窝芯恐靥接懴颊咄庵苎獮V泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)調(diào)控機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析南通大學(xué)附屬醫(yī)院2020年10月-2021年3月收治的哮喘患者42例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合哮喘臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）7 d內(nèi)未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑治療；（3）7 d內(nèi)無急性感染，無其他慢性病史；（4）患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）拒絕參加；（2）合并嚴(yán)重的器質(zhì)性病變；（3）惡性腫瘤；（4）依從性差。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度，分為急性發(fā)作組（n=23）、緩解組（n=19）；另選取同期在本院體檢的健康人群30例作為對照組。對照組中男15例，女15例；年齡7～45歲，平均（25.95±2.44）歲。急性發(fā)作組中，男11例，女12例；年齡9～48歲，平均（25.91±2.41）歲。緩解組中，男9例，女10例；年齡8～48歲，平均（25.64±2.81）歲。三組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本次研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 采用流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh細(xì)胞的分化數(shù)量所有患者均于清晨采集空腹靜脈血，肝素鋰抗凝處理后，將100 μl的全血置于15 ml的離心管中，分別加入：10 μl PE-CD278、10 μl FITC-CD4、5 μl PerCP-cyTM-5.5-CXC R5流式抗體，避光孵育半小時后，加入1 ml xBECKMAN Optil-yse C，輕輕混勻后避光15 min。使用離心機進行離心處理（3 000 r/min，5 min），棄上清后收集細(xì)胞，細(xì)胞使用2 ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進行洗滌，隨后再次離心（1 000 r/min，5 min），棄上清后收集細(xì)胞。隨后根據(jù)適合體積的PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，再次離心處理（1 000 r/min，5 min）。所有試劑均購于BD公司。

1.2.2 外周血中Tfh胞內(nèi)細(xì)胞因子合成水平 采用流式細(xì)胞術(shù)激活細(xì)胞后分別對Tfh細(xì)胞膜表面分子CD4和CXCR5及胞內(nèi)特征性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）和白細(xì)胞介素-21（IL-21）進行熒光染色，采用流式細(xì)胞術(shù)分析Tfh細(xì)胞內(nèi)IL-4和IL-21的合成水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本次試驗采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平對比

對照組的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達(dá)水平高于急性發(fā)作組、緩解組，CD4+ICOS+CXCR5+表達(dá)水平及IL-4、IL-21水平低于急性發(fā)作組、緩解組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；急性發(fā)作組的CD4+ICOS+CXCR5+表達(dá)水平及IL-4、IL-21水平高于緩解組，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達(dá)水平低于緩解組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 三組外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平對比（±s）

表1 三組外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平對比（±s）

*與對照組比較，P<0.05；#與急性發(fā)作組比較，P<0.05。

組別 CD4+ICOS+ CD4+CXCR5+ CD4+ICOS+CXCR5+ IL-4（ng/L） IL-21（ng/L）對照組（n=30） 10.84±1.22 3.59±0.31 4.07±0.52 55.45±5.42 15.49±1.94急性發(fā)作組（n=23） 7.39±0.91* 1.49±0.46* 12.29±1.22* 188.92±23.55* 18.39±2.31*緩解組（n=19） 8.49±0.16*# 2.14±0.75*# 6.49±0.34*# 128.93±15.55*# 16.94±1.33*#F值 92.120 132.060 126.164 466.406 14.687 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

2.2 外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平與哮喘病情的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+與哮喘病情存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，CD4+ICOS+CXCR5+、IL-4、IL-21表達(dá)水平與哮喘病情存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），見表2。

表2 外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平與哮喘病情的相關(guān)性對比

3 討論

數(shù)據(jù)報道指出，近20年以來，青少年的支氣管哮喘的發(fā)病率不斷上升，約有40%的青少年患有哮喘[8-10]。有研究指出，發(fā)達(dá)國家兒童的患病率為10%～30%[11-13]。我國哮喘發(fā)病率相對發(fā)達(dá)國家低，但是隨著我國經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展、環(huán)境問題的加劇，我國支氣管哮喘患病率較10年前約增高1倍，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。哮喘的發(fā)生與多種炎癥因子的共同參與有關(guān)，現(xiàn)今多數(shù)研究認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和免疫球蛋白E（IgE）、免疫球蛋白G（IgG）等介導(dǎo)了支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展[14-16]。在免疫學(xué)角度，支氣管哮喘的發(fā)生與機體自身接觸過敏原而引發(fā)的超敏反應(yīng)有關(guān)，其主要表現(xiàn)為IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)。當(dāng)機體再次接觸過敏原時，IgE交聯(lián)導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒釋放炎性介質(zhì)引起氣道的高反應(yīng)性，進而引起哮喘發(fā)作[17]。哮喘不僅會對人們的身體健康造成影響，還會加重人們的生活負(fù)擔(dān)及精神壓力。臨床上對于哮喘尚無根治方法，針對此，加強對哮喘疾病發(fā)病機制的研究十分重要。

目前，多數(shù)學(xué)者均認(rèn)為，哮喘的發(fā)生與免疫功能紊亂有關(guān)，也是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的重要機制之一[18]。也有學(xué)者認(rèn)為，哮喘的發(fā)生與氣道炎癥有關(guān)[19]。有學(xué)者的研究認(rèn)為，Th1、Th2細(xì)胞通過分泌IL-4及γ-干擾素（IFN-γ）從而刺激B細(xì)胞增殖與類別轉(zhuǎn)換重組（CSR），從而產(chǎn)生免疫球蛋白，促進哮喘疾病的發(fā)生[20]。既往認(rèn)為，Th2是輔助B細(xì)胞的主要輔助性T細(xì)胞，Tfh細(xì)胞是最近新發(fā)現(xiàn)的一種輔助性T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴因子-6的調(diào)控下，輔助性T淋巴（Th）細(xì)胞可分化為Tfh細(xì)胞，該細(xì)胞能夠持續(xù)表達(dá)CXCR5，自分泌方式分泌IL-21。Tfh細(xì)胞比例失衡或功能失調(diào)參與了多種疾病的發(fā)生。Tfh細(xì)胞在自身免疫性疾病中的發(fā)生機制已經(jīng)得到了廣大學(xué)者的研究支持[21]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的Tfh細(xì)胞異常增多，這與患者自身靶器官受損、自身抗體失衡的嚴(yán)重程度有關(guān)[22-23]。

結(jié)合本次研究結(jié)果：對照組的CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達(dá)水平高于急性發(fā)作組、緩解組，CD4+ICOS+CXCR5+表達(dá)水平及IL-4、IL-21水平低于急性發(fā)作組、緩解組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；急性發(fā)作組的CD4+ICOS+CXCR5+表達(dá)水平及IL-4、IL-21水平高于緩解組，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+表達(dá)水平低于緩解組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。分析認(rèn)為，多種細(xì)胞及分泌均參與了IgE水平的調(diào)控，而哮喘患者IgE水平的高低與疾病息息相關(guān)，IgE上升，促進疾病的發(fā)展，也有學(xué)者的研究證實了這一觀點[24]。細(xì)胞因子微環(huán)境失衡也可能導(dǎo)致哮喘患者體內(nèi)IgE水平的提升，而IL-4調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞向Th2分化，從而促進B細(xì)胞分化，促進免疫球蛋白向IgE轉(zhuǎn)化，促進哮喘的發(fā)生。Spearman相關(guān)性分析顯示，CD4+ICOS+、CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+CXCR5+表 達(dá) 水 平 的 高低、IL-4、IL-21水平與哮喘病情存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。分析認(rèn)為，哮喘患者存在Th2細(xì)胞比例失衡，外周血分泌IL-4的T細(xì)胞比例也存在失衡，進而導(dǎo)致哮喘患者的免疫應(yīng)答偏移，發(fā)揮協(xié)同作用，進一步促進哮喘疾病的發(fā)生與發(fā)展[25]。

綜上所述，外周血濾泡輔助性T細(xì)胞可能參與了哮喘疾病的發(fā)生與發(fā)展，外周血濾泡輔助性T細(xì)胞表達(dá)水平與IL-4、IL-21水平高低可以作為哮喘疾病的評估與診斷指標(biāo)之一。