李亞軍，茹 毅，郝榮增，蔣成輝，王 偉，張 越，張貴才，劉華南，盧炳州，楊 洋，陶世宇，楊 銳，宋向東，陳 嬌，余四九，鄭海學(xué)*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的以腹瀉、繁殖障礙、免疫機能障礙等為主要特征的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，該病發(fā)病率高，死亡率低[2]，防治的難點在于BVDV進入機體后可造成免疫抑制和持續(xù)性感染，降低機體免疫力，易誘發(fā)其他病原的混合感染或繼發(fā)感染，是全球最重要的牛傳染病之一[3]。該病在我國20多個省、市及自治區(qū)廣泛流行且呈擴大趨勢[4]，導(dǎo)致我國的BVDV防控和凈化狀況不容樂觀。

BVDV屬于黃病毒科(Flaviviridea)瘟病毒屬(Pestivirus)，基因組由一個長度約12.3 kb的單鏈正義RNA分子組成[5]。BVDV有3種生物型，通常基于5′-UTR序列、基因組氨基端自身蛋白酶(Npro)或包膜糖蛋白(E2)區(qū)域分為BVDV-1型和BVDV-2型[6]，第3種遺傳物種BVDV-3型被描述為非典型的BVDV。目前，中國主要流行8個亞型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q[7]。BVDV基因組含有4個結(jié)構(gòu)蛋白，分別是P14(C)、gP48(E0)、gP25(E1)、gP53(E2)，其他的均為非結(jié)構(gòu)蛋白[5,8]。其中，E0、E1、E2組成了病毒的囊膜結(jié)構(gòu)，位于病毒的表面，而E2蛋白位于病毒的外表面，也是構(gòu)成病毒的主要免疫保護性抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性的中和抗體[9]。動物機體在感染BVDV或者接種滅活疫苗后，體內(nèi)主要產(chǎn)生針對結(jié)構(gòu)蛋白E2的抗體[10]，對于病原的檢測應(yīng)用，由E2蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體可以快速檢測BVDV的變異[11]。E2蛋白包括1個疏水序列和5個糖基化位點[12]，但由于E2蛋白的基因突變率高，不同的毒株之間的免疫原性不同，容易導(dǎo)致疫苗免疫失敗[13]。

有報道顯示，E2蛋白在細胞周期的維持中扮演著重要角色，它主要參與病毒和宿主的吸附、識別以及結(jié)合過程，還參與病毒的免疫逃逸[14]。吳桐忠等[15]構(gòu)建了表達E2蛋白的重組乳酸菌，結(jié)果表明，口服表達BVDV E2蛋白的重組乳酸菌可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的體液免疫反應(yīng)；何金科等[16]完成了E2蛋白多表位疫苗的篩選以及生物信息學(xué)驗證等，為多表位疫苗的設(shè)計提供了一種新的方法；張忠輝等[17]利用原核表達系統(tǒng)表達制備E2蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體；吳立君等[18]利用昆蟲表達系統(tǒng)表達E2蛋白，為診斷試劑盒的研制和亞單位疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。以上研究表明，BVDV E2蛋白已成為BVD基因工程疫苗和診斷試劑開發(fā)研制的重要靶標蛋白，而利用不同表達系統(tǒng)制備的E2蛋白免疫動物后，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生不同程度的細胞免疫或體液免疫應(yīng)答，因此，E2蛋白成為BVDV DNA疫苗和亞單位疫苗開發(fā)的首選抗原蛋白[19]。

目前，控制BVDV的傳播主要有兩種方法：消滅持續(xù)感染動物和疫苗接種。改良活疫苗或滅活疫苗主要用于BVDV疫苗接種計劃，但這些疫苗分別存在安全風(fēng)險或免疫保護不足等問題[20]。滅活疫苗對懷孕牛安全，但其免疫期短；而弱毒疫苗雖免疫期長，但對懷孕牛存在安全風(fēng)險[21]?；谝陨峡茖W(xué)問題，本研究以研制BVD亞單位疫苗為目標，成功利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)制備了BVDV結(jié)構(gòu)蛋白E2，實現(xiàn)了該蛋白在哺乳動物表達系統(tǒng)CHO細胞中高水平瞬時表達，通過免疫動物評價其免疫原性，為BVDV的基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物 新西蘭大白兔由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 BVDV-1 NADL疫苗標準株(BVDV-1型毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所-中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)、真核表達載體pcDNA3.1(+)、BVDV陽性血清由本實驗室保存。ExpiCHO懸浮細胞表達系統(tǒng)、親和層析Ni柱購自GE公司。XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB)公司。

主要儀器：PCR擴增儀(Thermo)、臺式超速冷凍離心機(Thermo)、紫外凝膠成像儀(GE)、純化儀(AKTA PURE 150)、激光共聚焦顯微鏡(萊卡公司)。

1.2 蛋白生物信息學(xué)分析和表達設(shè)計

利用SignalP 4.1 Server和TMHMM Server v.2.0網(wǎng)站軟件分析BVDV結(jié)構(gòu)蛋白E2信號肽及跨膜區(qū)域。根據(jù)分析結(jié)果，設(shè)計E2蛋白的重組真核表達質(zhì)粒。

1.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

參考BVDV-1 NADL疫苗標準株基因序列，設(shè)計擴增目的基因引物(如表1所示)，利用病毒RNA提取試劑盒常規(guī)提取RNA，以提取的RNA為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒擴增E2蛋白的基因片段，擴增程序:50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ (1 min·kb-1)，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，純化回收DNA。pcDNA3.1載體和回收的基因片段用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，切膠回收純化，使用T4 DNA連接酶連接，程序為16 ℃ 12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落增菌培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-BVDV-E2。

用XhoⅠ和HindⅢ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒均送生物公司進行測序鑒定，確定目的基因序列的正確插入，確保閱讀框完全正確。

表1 引物信息

1.4 蛋白的表達與純化

參照ExpiCHO表達系統(tǒng)試劑盒說明書方法，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BVDV-E2轉(zhuǎn)染ExpiCHO懸浮細胞，轉(zhuǎn)染的細胞置32 ℃、5% CO2、濕度90%條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)12 d，然后4 000g離心10 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行親和層析Ni柱純化。取純化后的目標蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE鑒定，并使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。

1.5 蛋白印跡試驗

將純化后的蛋白經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為12% SDS-PAGE電泳分離，通過半干式電轉(zhuǎn)膜法將蛋白抗原轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，分別使用抗小鼠His Tag單克隆抗體、BVDV陽性血清或BVDV-E2免疫血清為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG為二抗，對純化的BVDV-E2蛋白或BVDV感染細胞內(nèi)的病毒蛋白進行Western blot分析，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色后，高分辨率凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.6 免疫熒光(IFA)試驗

按照試驗要求設(shè)置對照組和試驗組；在激光共聚焦細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)MDBK細胞，接種病毒感染后48 h將細胞用PBS進行洗滌；用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，分別加入1 mL用一抗稀釋液按1∶100稀釋的免疫血清，4 ℃，孵育12 h；1×PBS洗滌3次，每次5 min，分別加入500 μL用1×PBS按1∶1 000稀釋的488標記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；1×PBS洗滌3次，每次5 min，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光并拍照分析。

1.7 動物免疫與抗體檢測

選取健康新西蘭大白兔6只，分為2組，每組3只，A組免疫純化的E2蛋白，B組為PBS對照組，首次免疫用300 μg·只-1的純化蛋白和等體積的弗式完全佐劑乳化，背部多點注射免疫兔；首次免疫第14天，按照300 μg·只-1的純化蛋白和等體積的弗式不完全佐劑乳化，背部多點注射進行二免，分別采集首免后第0、7、14、21、28天取全血，分離血清用于抗體檢測。

采用間接ELISA對E2蛋白免疫兔血清進行檢測，分析其免疫原性。用50 mmol·L-1碳酸鹽緩沖液將純化的BVDV-E2蛋白(50 ng·孔-1)包被于ELISA酶標板中，4 ℃孵育過夜。用1%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃，封閉2 h。將待檢血清用血清稀釋液按1∶2 000稀釋并加入反應(yīng)孔中，100 μL·孔-1，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃孵育1 h。HRP標記的山羊抗兔IgG抗體用血清稀釋液按1∶5 000稀釋后加入反應(yīng)孔中，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。TMB顯色，每孔50 μL，顯色10 min后，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，讀取OD450 nm值。

2 結(jié) 果

2.1 E2蛋白分析與表達設(shè)計

軟件分析結(jié)果顯示，SignalP 4.1 Serve軟件分析顯示E2蛋白不存在信號肽(圖1A)；TMHMM Server v.2.0軟件分析顯示E2蛋白有一個跨膜區(qū)(第344—366位氨基酸)(圖1B)。本研究根據(jù)分析結(jié)果，刪除E2蛋白跨膜區(qū)，在目標蛋白氨基端插入信號肽序列、羧基端為His-Tag，依次串聯(lián)組成蛋白表達閱讀框(圖1C)。

2.2 E2重組表達質(zhì)粒的鑒定

RT-PCR擴增結(jié)果經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定顯示，基因擴增片段大小約為1 330 bp，與預(yù)期的目的條帶大小相符(圖2A)。構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-BVDV-E2經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后產(chǎn)生大小約5 109和1 358 bp的2條特異性條帶，酶切產(chǎn)物大小與理論值相符，表明擴增的E2片段正確與載體連接，而基因測序結(jié)果也顯示目的片段成功插入表達載體中(圖2B)。

2.3 E2蛋白的表達與純化

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BVDV-E2質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)上清在56 ku左右(圖中箭頭所示)位置處觀察到特異性蛋白條帶，蛋白大小與理論值相符(圖3A)。對BVDV-E2蛋白進行純化，洗脫樣品在56 ku左右位置處觀察到特異性蛋白條帶，BCA蛋白定量試劑盒測定純化后E2蛋白的質(zhì)量濃度為1.228 mg·mL-1(圖3B)。

2.4 重組蛋白的鑒定

純化后BVDV-E2蛋白能夠與His-Tag標簽抗體(圖4A)和BVDV陽性血清(圖4B)發(fā)生反應(yīng)，都約在56 ku位置處顯示一條特異性條帶。

將BVDV感染MDBK細胞24 h，利用BVDV-E2免疫兔血清檢測細胞內(nèi)的病毒蛋白表達，結(jié)果顯示約在56 ku位置處顯示一條特異性蛋白條帶(圖4C)，表明該E2蛋白免疫血清可以特異性地與BVDV感染細胞內(nèi)的E2蛋白反應(yīng)。

A.E2蛋白信號肽分析結(jié)果；B.E2蛋白跨膜區(qū)分析結(jié)果；C.BVDV-E2蛋白表達質(zhì)粒示意圖A. Result of E2 protein signal peptide sequence analysis; B. Result of E2 protein transmembrane region analysis; C. Diagram of expression plasmid of BVDV-E2 protein圖1 BVDV-E2蛋白分析與表達設(shè)計Fig.1 Analysis and expression design of BVDV-E2

2.5 細胞免疫熒光(IFA)試驗

IFA鑒定結(jié)果顯示(圖5)，BVDV感染MDBK細胞后，免疫血清可以特異性檢測到細胞內(nèi)的病毒蛋白表達，而對照組未檢測到熒光；結(jié)果表明，本研究制備的E2蛋白免疫血清具有良好的免疫反應(yīng)性和特異性。

2.6 血清抗體水平

間接ELISA結(jié)果顯示(圖6)，免疫后7 d，即可檢測到針對E2蛋白的血清抗體，二免7 d后抗體水平顯著升高，在免疫后28 d抗體保持較高水平且血清效價可達1∶1 024 000。結(jié)果證明了CHO細胞表達的E2蛋白具有良好的免疫原性。

3 討 論

近年來，關(guān)于BVD基因工程疫苗研究在不斷地進行，但仍無商品的亞單位疫苗可用[22]。E2蛋白作為BVDV囊膜上的重要結(jié)構(gòu)蛋白，擁有突出囊膜表面的氨基端部分，決定了BVDV的抗原性[23]，其免疫原性最好，是亞單位疫苗研究的主要抗原蛋白[24-25]。

A.RT-PCR擴增基因片段鑒定(M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.E2基因片段)；B.重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定(M. DL10000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.未酶切E2表達質(zhì)粒；2.E2表達質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物)A. Identification of gene fragments amplified by RT-PCR(M. DL2000 DNA marker; 1. E2 gene fragment); B. Identification of recombinant expression plasmid by double enzyme digestion (M. DL10000 DNA marker; 1. Undigested E2 expression product; 2.Digested E2 expression product)圖2 重組表達質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant expression plasmid

A.E2蛋白表達的SDS-PAGE分析(M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.空白對照；2.空載體對照；3.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BVDV-E2)；B.純化后E2蛋白SDS-PAGE分析(M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.過濾后細胞上清；2.流穿樣品；3.洗脫樣)A. SDS-PAGE analysis of the expression of E2 protein (M. Protein marker; 1. Blank control; 2. Empty plasmid control; 3. Transfected pcDNA3.1-BVDV-E2); B. SDS-PAGE analysis of E2 protein after purification (M. Protein marker; 1. Cell supernatant after filtration; 2. Flow through sample; 3. Elution sample)圖3 重組蛋白的表達與純化Fig.3 Expression and purification of recombinant protein

A.一抗為His-Tag單克隆抗體(M.預(yù)染的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.BVDV-E2)；B.一抗為BVDV多克隆抗體(M.預(yù)染的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.BVDV-E2)；C.E2蛋白免疫血清檢測BVDV感染MDBK細胞的免疫印跡分析(M.預(yù)染的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.未感染細胞對照；2.BVDV感染MDBK細胞)A. Western blot identification with His Tag monoclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); B. Western blot identification with BVDV polyclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); C. Analysis of E2 protein expression in MDBK cells after BVDV infection by Western blot (M. Protein marker; 1. Uninfected cell control; 2. BVDV infected MDBK cells )圖4 純化后E2蛋白的免疫印跡分析Fig.4 Analysis of E2 protein after purification by Western blot

圖5 IFA鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of immunized serum by IFA

NC. PBS免疫組；E2. BVDV-E2蛋白免疫組NC. The group of immunized by PBS; E2. The group of immunized by purified E2 protein圖6 間接ELISA分析血清抗體Fig.6 Analysis of serum antibodies by indirect ELISA

目前，在國內(nèi)關(guān)于BVDV E2蛋白表達的相關(guān)研究中，大多數(shù)采用原核表達系統(tǒng)進行表達[10,17,26]，也有報道利用煙草等真核表達系統(tǒng)表達E2蛋白[18,27]。BVDV E2蛋白為囊膜糖蛋白，含有多個糖基化位點，其翻譯后修飾較為復(fù)雜，利用原核表達系統(tǒng)表達此類抗原蛋白存在一定的難度，且原核表達的產(chǎn)物抗原性一般較弱，并且大多數(shù)情況表達產(chǎn)物以不可溶形式存在，蛋白結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾與真核表達存在較大差異[28]。通過真核表達系統(tǒng)表達的目的蛋白具有天然蛋白的構(gòu)象和活性，與昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)相比，CHO細胞表達系統(tǒng)表達產(chǎn)量相對比較高，很少分泌自身內(nèi)源性蛋白，利于外源產(chǎn)物的分離純化；與細菌表達系統(tǒng)相比，CHO細胞表達系統(tǒng)可對蛋白進行翻譯后加工，可胞外分泌表達，下游純化工藝簡單；與酵母表達系統(tǒng)相比，CHO細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)物的免疫原性等生物活性與天然蛋白更相似，能夠有效減少非特異性結(jié)合[29]。隨著無血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)、基因工程技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和不斷發(fā)展，CHO細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)物表達量得到大幅提升，生產(chǎn)成本不斷降低，在獸用產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用也顯現(xiàn)出良好前景[30]。本研究為了獲得免疫原性良好的BVDV抗原蛋白，使用CHO懸浮細胞對目標抗原進行分泌表達，并通過親和層析法進行純化，通過一步親和純化即可獲得較高純度的抗原蛋白，并且蛋白表達量顯著高于其他報道水平；為CHO細胞表達系統(tǒng)在獸用生物制品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的范例。

4 結(jié) 論

本研究首次成功利用CHO細胞表達細胞制備了BVDV E2蛋白，鑒定結(jié)果顯示，E2蛋白與BVDV陽性血清和His標簽抗體有良好的反應(yīng)性，同時免疫結(jié)果顯示，制備的E2蛋白可誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生強烈的體液免疫反應(yīng)，免疫后第28天抗體水平仍保持較高水平；此外，利用動物免疫血清可特異性檢測感染細胞內(nèi)的病毒蛋白表達。本研究結(jié)果為BVD新型亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。