◆作者：覃美運(yùn)楊曦＊羅琴劉成模陳小燕任秋香

◆單位：1.廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南水產(chǎn)與畜禽飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

氨基酸分析儀在各領(lǐng)域都被人們高度重視。氨基酸分析是現(xiàn)代飼料工業(yè)和食品工業(yè)實(shí)施質(zhì)量控制以及臨床醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)研究領(lǐng)域必不可少的手段。1958年，Spackman、Moor和Stein合作研制出世界上第一臺(tái)用離子交換樹(shù)脂和柱后茚三酮衍生檢測(cè)的自動(dòng)氨基酸分析儀，使用氨基酸定量分析進(jìn)入一個(gè)嶄新階段。氨基酸分析儀的核心部件是離子交換柱。氨基酸分析儀主要靠它把具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離開(kāi)來(lái)進(jìn)行定量，所以說(shuō)離子交換柱是氨基酸分析儀的心臟，可見(jiàn)離子交換柱中樹(shù)脂的重要性。因此，本文詳細(xì)介紹了英國(guó)百康30+全自動(dòng)氨基酸分析儀的分析柱填料的清洗、活化、裝填及效果驗(yàn)證等過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)氨基酸分析儀：30+型，英國(guó)百康公司；離心機(jī)：TDZ5-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

甲醇（分析純）、乙二胺四乙酸（EDTA）（分析純）、濃鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、緩沖液6（0.4mol/L氫氧化鈉溶液），緩沖液3（檸檬酸鈉19.6 g，濃鹽酸15.5 mL，苯酚1.2 g，異丙醇50 mL，加超純水定容至1 L并調(diào)節(jié)pH值為2.65的溶液），緩沖液4（檸檬酸鈉7.35 g，濃鹽酸1.5 mL，苯酚1.2 g，氯化鈉23.49 g，硼酸鈉4.77 g，L-羥脯氨酸0.00197 g，加超純水定容至1L并調(diào)節(jié)pH值為8.6）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 樹(shù)脂清洗試驗(yàn)

取出樹(shù)脂，打開(kāi)分析柱一頭，將未打開(kāi)一頭接到儀器。將Biosys Manual軟件打開(kāi)，勾上Override，然后將分析柱下端柱套打開(kāi)，用緩沖液6將樹(shù)脂沖出，接入一個(gè)干凈燒杯中，直至柱中只流出透明緩沖液，代表樹(shù)脂已從分析柱中徹底沖出，然后將分析柱與儀器連接管路斷開(kāi)。由于清洗過(guò)程中會(huì)有微量的柱填料損失，需要將色譜柱包裝盒中自帶同批號(hào)的柱填料補(bǔ)充到燒杯。

1.2.2 樹(shù)脂清洗過(guò)程

將甲醇溶液（200 mL超純水+100 mL甲醇）加入燒杯中，微沸后繼續(xù)小火加熱30 min，邊加熱邊不停攪拌。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，當(dāng)混合液冷至室溫后，過(guò)濾或離心除去清洗液，用100 mL超純水重復(fù)清洗樹(shù)脂2-3次。再加入200 mL超純水、4 g EDTA和200 mL濃鹽酸，濃鹽酸加入時(shí)邊加邊攪拌。溶解后加熱，微沸后繼續(xù)小火加熱60 min，邊加熱邊不停攪拌（注：EDTA一共加4 g，與溶液體積無(wú)關(guān)）。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，混合后冷卻至室溫，過(guò)濾或離心除去清洗液，然后用100 mL超純水重復(fù)清洗樹(shù)脂3-5次。在樹(shù)脂中加入200 mL 6號(hào)Buffer，加熱，微沸后繼續(xù)小火加熱30 min，邊加熱邊不停攪拌。從加熱裝置取下燒杯，加入100 mL超純水，混勻后冷卻至室溫，過(guò)濾或離心除去清洗液，然后用100 mL超純水重復(fù)清洗樹(shù)脂2-3次。最后在樹(shù)脂中加入最小體積6號(hào)Buffer，轉(zhuǎn)移到樹(shù)脂瓶中儲(chǔ)存。

1.2.3 分析柱裝填過(guò)程

將延長(zhǎng)柱與分析柱打開(kāi)一頭連接，注意與分析柱連接一邊的延長(zhǎng)柱中應(yīng)放入白色密封圈防止漏液，上端管路接在分析柱用緩沖液6將分析柱身填滿，當(dāng)延長(zhǎng)柱有微量緩沖液流出時(shí)再往里加樹(shù)脂，目的是保證完全排出柱身中的空氣，延長(zhǎng)柱一次性裝完樹(shù)脂避免出現(xiàn)填充密度不均勻的現(xiàn)象。

將樹(shù)脂混懸液倒入或者用滴管轉(zhuǎn)移進(jìn)入延長(zhǎng)柱，用緩沖液6補(bǔ)齊延長(zhǎng)柱中空間（必須用緩沖液6填滿，否則會(huì)填入空氣），蓋上上蓋（此時(shí)注意提起上蓋的小柱子防止它把延長(zhǎng)柱上端的液體排出導(dǎo)致進(jìn)入空氣），并將上流端口的管路連接到延長(zhǎng)柱上端擰緊（注意分析柱與延長(zhǎng)的接口端是不一樣的，延長(zhǎng)柱的接口端需要將管路拉長(zhǎng)插入延長(zhǎng)柱確保不漏氣，保持壓力穩(wěn)定）。觀察幾分鐘未漏液就可以將兩端都接上儀器管路，放入柱溫箱，此時(shí)在Biosys Manual軟件界面設(shè)置線圈135℃，柱溫設(shè)置為50℃。在BiosysManual軟件界面選擇緩沖液6，調(diào)節(jié)流速使緩沖液壓力在85~90 bar左右（開(kāi)始時(shí)壓力很小，可以加大流速，隨著壓力不斷增加可以逐漸減小流速），觀察壓力在2~3min內(nèi)始終穩(wěn)定，可以認(rèn)定壓力穩(wěn)定，當(dāng)壓力穩(wěn)定后確定流速，此時(shí)可以建立一個(gè)自動(dòng)切換沖洗程序，復(fù)制一個(gè)再生程序按以下要求填寫(xiě)：

用確定后的流速?zèng)_洗緩沖液6沖洗30 min，柱溫設(shè)置為50℃。用同樣流速緩沖液4沖洗1 h，柱溫設(shè)置為50℃。用同樣流速緩沖液3沖洗1 h，柱溫設(shè)置為50℃。此時(shí)壓力應(yīng)該在120 bar左右。如果沒(méi)有到達(dá)，加大流速使之達(dá)到120 bar左右，再?zèng)_洗10 min（注意：此階段關(guān)注壓力，當(dāng)壓力過(guò)大降低流速，控制壓力在120 bar左右），壓力過(guò)大會(huì)擠破分析柱另一頭的篩板）。打開(kāi)分析柱與延長(zhǎng)柱，這時(shí)分析柱的樹(shù)脂應(yīng)該是平的。裝好分析柱，即可使用。將延長(zhǎng)柱中樹(shù)脂沖出，重新裝入樹(shù)脂罐中，以便下次再用。延長(zhǎng)柱用水洗，然后再用無(wú)水乙醇沖洗，晾干。注意：分析柱接頭部分是塑料材質(zhì)，請(qǐng)不要使勁擰，以免破裂，可以在連好儀器后，在使用緩沖液沖時(shí)，如果有漏液，再稍微擰緊。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸分析柱要清洗活化的原因

氨基酸分析柱中的離子交換樹(shù)脂為什么要清洗？在什么情況下要清洗樹(shù)脂？長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)程樣品中的雜質(zhì)吸附在樹(shù)脂上會(huì)發(fā)生樹(shù)脂污染，一般來(lái)源于樣品前處理，通過(guò)嚴(yán)格的前處理是可以在一定程度上避免污染的發(fā)生，但當(dāng)樹(shù)脂被污染時(shí)，會(huì)出現(xiàn)峰型不規(guī)則，分離度差，伴隨柱壓高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)分離度越來(lái)越差的現(xiàn)象。本試驗(yàn)先選擇有機(jī)溶劑甲醇溶液清洗，目的是清洗掉吸附在樹(shù)脂上的疏水性物質(zhì)，例如烷烴、油、脂肪等雜質(zhì)。然后再加入乙二胺四乙酸和濃鹽酸，目的是清洗蛋白質(zhì)及金屬污染物，最后加入6號(hào)buffer緩沖液清洗碳水化合物。

2.2 清洗、活化和裝填后的性能分析

全自動(dòng)氨基酸分析儀的分析柱是采用惰性PEEK材料，填料可耐受高堿濃度再生試劑、高溫（99℃）再生程序，性能好，價(jià)格高。通過(guò)本文講述清洗樹(shù)脂的試驗(yàn)及填裝分析柱的方法可以恢復(fù)分析柱性能（圖1）。通過(guò)和新購(gòu)入色譜柱完成的色譜圖（圖2）對(duì)比各個(gè)峰的分離度和柱效幾乎和新購(gòu)入分析柱一致，經(jīng)過(guò)近4個(gè)月的使用，分離度和柱效無(wú)明顯下降。因此，清洗樹(shù)脂并自行裝填分析柱是恢復(fù)分析柱性能的一種非常有效的方法，清洗后可使用較長(zhǎng)時(shí)間，較好節(jié)約檢測(cè)成本。

圖1 重新裝填后色譜柱樣品色譜圖

圖2 新購(gòu)入色譜柱樣品色譜圖

2.3 樣品分析

通過(guò)清洗、活化和裝填后的氨基酸分析柱，完成對(duì)日常樣品的檢測(cè)，通過(guò)與新購(gòu)入的氨基酸分析柱對(duì)比結(jié)果（表1），兩者之間無(wú)顯著差異。

表1 重新裝填分析柱和新購(gòu)入分析柱對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

建立了一種對(duì)已使用較長(zhǎng)時(shí)間且柱效較差氨基酸分析柱進(jìn)行重新處理和裝填的方法，填充后的柱效和新購(gòu)入分析柱無(wú)顯著差異。通過(guò)近4個(gè)月的使用，效果無(wú)明顯下降，是恢復(fù)分析柱性能的一種非常有效的方法，能大幅節(jié)約檢測(cè)成本。

參考文獻(xiàn):(略)