覃宏婷， 龔道勇，2， 李 標(biāo)

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400045)

0 引 言

石斛堿屬于倍半萜類生物堿，擁有Picrotoxane骨架并形成N環(huán)和內(nèi)酯環(huán)，具有獨(dú)特的4環(huán)稠合結(jié)構(gòu)[1]。金釵石斛作為石斛藥材的基源植物之一，石斛堿被《中國(guó)藥典》指定為其特征性成分[2]。石斛是我國(guó)傳統(tǒng)常用名貴中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，益胃生津，滋陰清熱?！吨袊?guó)藥典》中又稱其干品為楓斗，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足。石斛在石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛提取液、石斛衛(wèi)青粉等中成藥制劑中廣泛使用[3]。在現(xiàn)代藥理研究中，石斛堿表現(xiàn)改善腸胃功能[4]、神經(jīng)保護(hù)[5]、心血管保護(hù)[6]、抗炎[7]、抗流感病毒[8]等多種藥理活性。石斛堿的合成通過植物中的萜類合成途徑。其下游的生物合成途徑包括骨架的形成及后修飾，骨架的形成一般由萜類合酶催化產(chǎn)生環(huán)化和重排等，后修飾一般由CYP450酶催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生各種官能團(tuán)、脂環(huán)。

CYP450酶是最大的蛋白質(zhì)酶超家族，長(zhǎng)期以來因其作為多功能生物催化劑的廣泛運(yùn)用而備受關(guān)注[9]。第一種被成功克隆的植物CYP450酶是Bozak等[10]從牛油果植株中所得到。此后發(fā)現(xiàn)CYP450酶廣泛分布于高等植物中，參與初級(jí)代謝和各種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。CYP450酶催化的最常見的反應(yīng)是氧化反應(yīng)，特殊的還有擴(kuò)環(huán)功能[11]。由此可以看出，CYP450酶的氧化參與后期結(jié)構(gòu)修飾，從功能上鑒定參與石斛堿合成途徑的CYP450酶就顯得尤為重要。

本文綜述了萜類化合物石斛堿生物合成的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)石斛堿的合成研究節(jié)點(diǎn)為CYP450酶功能挖掘；同時(shí)總結(jié)了幾種藥用萜類青蒿酸、丹參酮、鼠尾草酸、人參皂苷、甘草甜素等合成途徑中CYP450酶的鑒定和研究手段，發(fā)現(xiàn)CYP450酶在這幾種萜類中的作用主要是氧化或者多步氧化，氧化的形式有羥基化、羰基化等。本文首次從CYP450酶的功能角度詳細(xì)分析石斛堿的合成研究進(jìn)展，以期為石斛堿生物合成途徑中的CYP450酶的挖掘和鑒定提供參考。

1 倍半萜類石斛堿生物合成研究進(jìn)展

1.1 倍半萜生物合成途徑

倍半萜類化合物是一大類植物天然產(chǎn)物，其基本骨架來源于異戊二烯五碳結(jié)構(gòu)單元(IPP和DMAPP)的縮合。該生物合成被分為2個(gè)階段，即上游共同前體產(chǎn)生的階段以及下游的骨架形成和后修飾階段，如圖1所示。其共同前體IPP及其同分異構(gòu)體DMAPP通過兩種途徑合成，即MVA與MEP途徑；MEP途徑也稱為非甲羥戊酸酯途徑[12]。MVA途徑位于細(xì)胞質(zhì)或過氧化物酶體中，它起始于乙酰輔酶A(acetyl-CoA)，以通用異戊二烯前體IPP及其同分異構(gòu)體DMAPP的產(chǎn)生而結(jié)束。植物中，所有MEP途徑的酶都位于質(zhì)體中；丹參酮和其他二萜主要通過MEP途徑合成[13]。

(a) MVA和MEP途徑

前體IPP和DMAPP被用來構(gòu)建萜類骨架，主要由萜類合酶催化。根據(jù)異戊二烯單元(C5)的數(shù)量，萜類化合物可分為半萜類(C5)、單萜類(C10)、倍半萜類(C15)、二萜類(C20)、三萜類(C30)、四萜類(C40)和多萜類。IPP與DMAPP在異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(Isopentenyl Diphosphate Isomerase，IDI)的催化可以互相轉(zhuǎn)化。隨后，IPP和DMAPP在異戊二烯轉(zhuǎn)移酶(Prenyltransferase)的催化下生成異戊二烯基二磷酸(Prenyl Diphosphate)，異戊二烯轉(zhuǎn)移酶也稱為異戊二烯基二磷酸化合酶(Isoprenyl Diphosphate Synthase)，包括香葉基二磷酸合酶(Geranyl Diphosphate Synthase，GPPS)、法呢基二磷酸合酶(Farnesyl Diphosphate Synthase，F(xiàn)PPS)和香葉基香葉基二磷酸合酶(Geranylgeranyl Diphosphate Synthase，GGPPS)。GPPS被認(rèn)為參與質(zhì)體中單萜和一些二萜如赤霉素的生物合成。FPPS將兩個(gè)分子的IPP與一個(gè)分子的DMAPP首尾依次縮合，在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生倍半萜和三萜的前體(E，E)-法呢基焦磷酸((E,E)-Farnesyl Pyrophosphate，F(xiàn)PP)，同位素示蹤實(shí)驗(yàn)表明石斛堿在這一步的前體為FPP。IPP和DMAPP也以不同的方式縮合形成(E，E，E)-香葉基香葉基二磷酸酯((E,E,E)-Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP)，它是植物中二萜類化合物包括丹參酮、類胡蘿卜素、赤霉素、生育酚和葉綠素等的前體[14]。隨后，后修飾酶進(jìn)一步將環(huán)化骨架修飾成各種萜類化合物。萜類化合物后修飾酶的修飾主要包括骨架結(jié)構(gòu)重排、羥基化、?；吞腔?。

1.2 石斛堿的生物合成研究

石斛堿首次被發(fā)現(xiàn)是1932年，日本學(xué)者Suzuki[15]從金釵石斛中分離獲取并測(cè)得其分子式及部分性質(zhì)；在后續(xù)的研究中逐漸確定石斛堿的立體結(jié)構(gòu)，并對(duì)其含量和藥理作用進(jìn)行了更廣泛的研究。石斛堿生物合成的探索始于1966年，Yamazaki等[16]利用14C同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)參與了石斛堿的生物合成，并第一次提出萜類途徑參與了石斛堿的生物合成。后續(xù)研究在這一基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，不僅標(biāo)記了碳原子(14C)，還標(biāo)記了氚原子(3H)，進(jìn)一步證明法呢基焦磷酸(Farnesyl Pyrophosphate，F(xiàn)PP)是石斛堿生物合成的關(guān)鍵中間體化合物；推測(cè)FPP的磷酸基團(tuán)位置與異丙基上的C發(fā)生環(huán)化和去磷酸，隨后通過進(jìn)一步環(huán)化產(chǎn)生牻牛兒烷(Muurolane)[17]?；诖?，石斛堿的生物合成途徑被認(rèn)為有MVA途徑參與，并形成FPP的前體異戊烯基焦磷酸(Isopentenyl Dip-hosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl Diphosphate，DMAPP)；又因?yàn)镮PP與DMAPP的形成還可通過2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸(2-C-Methyl-D-Erythritol 4-Phosphate，MEP)途徑，且沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明石斛堿與MEP途徑無關(guān)，所以推測(cè)中一般將形成IPP與DMAPP的兩條途徑MVA和MEP共同看作石斛堿生物合成的上游途徑。在這之后，陸續(xù)有學(xué)者提出從FPP到石斛堿合成過程的結(jié)構(gòu)變化途徑假說[18]，這些假說途徑均通過合成Picrotoxane骨架最后生成石斛堿。由于石斛堿具有Picrotoxane型倍半萜骨架，在萜類化合物中屬于Picrotoxane型倍半萜，其合成途徑與倍半萜相似。因此，倍半萜生物合成途徑日益受到學(xué)者的重視。

基于倍半萜的生物合成途徑和前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題組[3,19]分析了金釵石斛中提取的20種單體化合物，推測(cè)了石斛堿的生物合成途徑，如圖1所示。IPP和DMAPP通過MVA途徑從acetyl-CoA起始，最終在FPPS酶的作用下產(chǎn)生FPP。石斛堿的生物合成下游途徑始于FPPS酶的催化作用；其次，在萜類合酶的催化下，F(xiàn)PP發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，形成Muurolene-lactone(圖1b)；該化合物再發(fā)生重排形成Copacamphane-lactone；在CYP450酶的催化下，Copacamphane-lactone生成石斛堿的基本骨架Picrotoxane-lactone。形成基本骨架后，經(jīng)過氧化、甲基化及胺化最終生成石斛堿。這三步可能通過不同的順序進(jìn)行反應(yīng)生成石斛堿，一方面， Picrotoxane型倍半萜可環(huán)化形成Dendronobilin C，然后胺化形成Mubironine B，Mubironine B進(jìn)一步甲基化形成石斛堿；另一方面，它們也可以直接胺化產(chǎn)生Nobilline，Nobilline環(huán)化和脫羧形成石斛堿。途徑上的骨架化合物推測(cè)都來源于從石斛屬植物中分離純化得到的類似化合物(圖1方框所示)。在這條推測(cè)路徑上，TPS、CYP450、甲基轉(zhuǎn)移酶和氨基轉(zhuǎn)移酶都可能是參與石斛堿生物合成途徑的關(guān)鍵酶，其中CYP450酶的氧化功能對(duì)石斛堿骨架的后修飾起到關(guān)鍵作用。

雖然推測(cè)了石斛堿可能的生物合成途徑，但關(guān)于石斛堿合成中間體化合物和關(guān)鍵酶基因鮮有報(bào)道。在金釵石斛及石斛屬植物化合物分離過程中發(fā)現(xiàn)大量具有Picrotoxane骨架的化合物，基于此，在分離得到的Picrotoxane型化合物作為底物的情況下使用CYP450酶研究該類化合物如何通過氧化、酯化等修飾作用最終得到石斛堿就顯得尤為重要。在石斛堿合成中間體化合物的挖掘上，本課題組從金釵石斛干燥莖中分離得到兩個(gè)Picrotoxane骨架化合物，其中一個(gè)為新結(jié)構(gòu)化合物[20]，將為接下來基因功能的研究提供底物。另一方面，本課題組對(duì)石斛堿合成通路中合成酶的挖掘也取得一定進(jìn)展。對(duì)于石斛堿合成的上游途徑，到目前為止，本課題組已經(jīng)克隆了HMGS[21]、HMGR[22]和MVD[23]基因，這些基因與石斛堿生物合成上游途徑相關(guān)。對(duì)于石斛堿的下游的未知部分，已經(jīng)成功構(gòu)建FPPS酶的體外表達(dá)與功能驗(yàn)證，建立起成熟的研究體系；本課題組[24]還通過菌根真菌MF23的誘導(dǎo)，篩選出誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上調(diào)的基因序列，得到了4個(gè)可能與石斛堿合成途徑高度相關(guān)的CYP450酶基因CYP71D10、CYP71D55、CYP735A和CYP94C1。CYP71D10、CYP71D55、CYP735A屬于CYP71多家族，CYP94C1屬于CYP86多家族。為了深入探究CYP450酶對(duì)石斛堿合成的作用，總結(jié)萜類的CYP450酶功能和研究手段十分必要。

2 植物萜類生物合成的CYP450酶

2.1 CYP450 基因家族分類

MVA或MEP途徑的萜類前體經(jīng)萜類合酶形成基本骨架后，需要隨后的修飾和重排過程來形成最終萜類化合物，這種后修飾作用主要是通過CYP450酶的催化。細(xì)胞色素P450酶廣泛參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成，是一個(gè)龐大的基因家族，具有多個(gè)分支，通常為催化氧化反應(yīng)。

同一家族或亞家族中的CYP450酶可能催化同一途徑中的連續(xù)步驟或不同底物上的類似反應(yīng)。陸生植物CYP450酶分為CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746七個(gè)單家族以及CYP71、CYP72、CYP85、CYP86四個(gè)多家族[25]。CYP71多家族包含了植物次生代謝產(chǎn)物合成的多數(shù)CYP450酶[26]。

單家族一般編碼同一類重要的功能酶。CYP51是最古老和保守的真核細(xì)胞CYP450酶之一，催化甾醇合成中的甾醇14α-sterol的脫甲基反應(yīng)[27]。此外，CYP51H10有助于通過β-amyrin的羥基化和環(huán)氧化進(jìn)行avenacin A-1的生物合成[28]。CYP710可能從CYP51進(jìn)化而來，CYP710家族的CYP710A也參與甾醇的生物合成，表現(xiàn)出以β-sitosterol的C-22位去飽和作用[29]。MAX1屬于CYP711家族，在類胡蘿卜素(Carotenoid)衍生而來的芽體分枝抑制激素的合成中起作用[30]。另一個(gè)家族CYP74，通常催化脂肪酸的過氧化氫轉(zhuǎn)化[31]。CYP97家族在類胡蘿卜素的生物合成中起作用，具有催化β-carotene環(huán)上羥基化的活性[32]?？傊珻YP51和CYP710家族都參與甾醇合成，而CYP711和CYP97家族在類胡蘿卜素途徑中發(fā)揮作用，CYP74家族與多重不飽和脂肪酸的氧化代謝有關(guān)[33]。在多家族中，CYP86家族更保守，只有四個(gè)家族，它們與脂肪酸及其衍生物的代謝有關(guān)[34]。CYP85家族與萜類植物激素代謝有關(guān)[35]。CYP720是CYP85家族的成員，參與針葉樹防御相關(guān)的萜類生物合成[36]。CYP72家族與脂肪酸、萜類、植物激素和細(xì)胞分裂素的代謝有關(guān)[37]。CYP71作為植物中最大的CYP450家族具有巨大的功能多樣性，包括氨基酸衍生物、萜類化合物、生物堿、脂肪酸和激素前體的代謝[38]。

參與藥用植物萜類生物合成的CYP450主要分布在CYP71、CYP85和CYP72家族中。金釵石斛轉(zhuǎn)錄組中篩選的CYP450酶屬于CYP71、CYP73和CYP94這三個(gè)多家族。修飾和催化形成青蒿素、丹參酮、鼠尾草酸、人參皂苷、甘草甜素的CYP450酶分別在CYP71、CYP72、CYP85、CYP86個(gè)多家族中都有出現(xiàn)，其功能都非常相似，都是催化底物發(fā)生一步氧化(羥基化)或者多步氧化(醛基化)，如表1。特殊的有丹參酮途徑中的CYP76AH1能夠催化丹參酮二烯的芳構(gòu)化。

表1 植物藥用萜類合成的CYP450 基因家族分類

2.2 萜類合成途徑CYP450酶功能研究

萜類合成途徑中CYP450酶的研究非常廣泛，例如青蒿素、丹參酮、鼠尾草酸、人參皂苷以及甘草甜素的合成途徑中CYP450酶解析比較透徹，為解析石斛堿生物合成途徑提供了重要依據(jù)。

青蒿素是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的有效抗瘧藥，與現(xiàn)有抗瘧藥相比，作用更快，毒性更低。CYP71AV1作為一種多功能倍半萜類氧化酶，在青蒿素生物合成途徑中起關(guān)鍵作用，參與中間體紫穗槐-4，11-二烯(Amorpha-4,11-diene)、青蒿素醇(Artemisinic alcohol)和青蒿素醛(Artemisinic aldehyde)的異丙基上多步氧化形成青蒿素酸(Artemisinic acid)[39]，見圖2(藍(lán)色)。

圖2 藥用萜類化合物的生物合成途徑及其與石斛堿的關(guān)系

二萜類丹參酮(Tanshinone)是中藥丹參中主要的親脂性生物活性成分，包括丹參酮Ⅰ、丹參酮IIA、隱丹參酮和二氫丹參酮I[49]。其中，丹參酮IIA被認(rèn)為是最重要的生物活性成分。近年來，丹參中丹參酮生物合成的基因組、轉(zhuǎn)錄組CYP450酶基因表達(dá)鑒定研究已有報(bào)道[40,50-52]。兩種重要的萜類環(huán)化酶，共烯丙基二磷酸合酶(Copalyl Diphosphate Synthase，CPS)和貝殼杉烯合酶(Kaurene Synthase-Like，KSL)，參與半日花烷(Labdane)相關(guān)二萜的生物合成。SmCPS1催化一般二萜前體GGPP環(huán)化為椰油酰二磷酸(Copalyl Diphosphate)[53]，再由SmKSL1進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丹參酮的前體丹參酮二烯(Miltiradiene)。CYP76AH1催化了一個(gè)獨(dú)特的四電子氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括芳構(gòu)化和在碳-12位引入氧原子，在丹參酮生物合成的后期生成彌羅松酚(Ferruginol)[40]，見圖2(粉色)。Ma等[54]通過RNAi技術(shù)下調(diào)CYP76AH1基因，導(dǎo)致Miltiradiene積累顯著增加，丹參酮含量降低，驗(yàn)證了其在丹參酮生物合成中的關(guān)鍵作用。此外，CYP76AH亞家族的一些其他成員也被證明在萜類生物合成中起類似的作用。CYP76AH4是丹參CYP76AH1的迷迭香直系同源物，通過芳香中間體Miltiradiene的羥基化，在酚類二萜生物合成中產(chǎn)生Ferruginol[42]。隨后的研究表明，CYP76AH3和CYP76AK1這兩個(gè)CYP450酶依次作用，形成丹參酮生物合成的分叉途徑[41]。RNAi和生化研究表明，這兩種CYP450酶都表現(xiàn)出多底物催化功能。CYP76AH3在C-11位羥基化形成11-羥基彌羅松酚(11-Hydroxy Ferruginol)，或先在C-7酮基化再C-11羥基化形成11-羥基柳杉酚(11-Hydroxy Sugiol)。CYP76AK1分別催化11-Hydroxy Ferruginol和11-Hydroxy Sugiol產(chǎn)生11，20-二羥基彌羅松酚(11,20-Dihydroxy Ferruginol)或11，20-二羥基柳杉酚(11,20-Dihydroxy Sugiol)。CYP76AH3在底物選擇性和催化活性方面表現(xiàn)出多樣性，而CYP76AK1表現(xiàn)出底物多樣性，這表明丹參酮生物合成過程中存在分叉。除此之外，CYP76AH3的敲除實(shí)驗(yàn)僅略微減少丹參酮的積累，這反映了CYP76AH3可能為非限速酶。相比之下，CYP76AK1的過表達(dá)增加了丹參酮產(chǎn)量，這表明它在丹參酮的生產(chǎn)中起著更加重要的作用。

Miltiradiene和Ferruginol是松香烷型(Abietane-type)二萜，不僅作為丹參中丹參酮的前體，也是迷迭香中鼠尾草酸(Carnosic acid)的前體。Bo?i等[55]篩選來自鼠尾草的三個(gè)候選CYP450酶基因SfFS、RoFS1和RoFS2(Ferruginol Synthases，F(xiàn)S)，并鑒定了其參與鼠尾草酸生物合成途徑。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這三個(gè)CYP450酶都屬于大CYP71家族的CYP76亞組，與唇形科CYP76AH1和CYP76AH4密切相關(guān)。在其他研究中，CYP76AH24、CYP76AK6和CYP76AK8催化了鼠尾草酸生物合成的大多數(shù)氧化反應(yīng)[43]，見圖2(淺粉色)。作為一種雙功能酶，CYP76AH24催化松香三烯(Abietatriene)的C-12和C-11連續(xù)氧化生成11-Hydroxy Ferruginol，與厚樸中的CYP76AH4具有相同的作用。由于連續(xù)氧化產(chǎn)生11-Hydroxy Ferruginol， CYP76AH4、CYP76AH22、CYP76AH23和CYP76AH24，都被重新命名為11-羥基彌羅松酚合酶(11-Hydroxy Ferruginol Synthases)[56]。迷迭香中的CYP76AK8是CYP76AK6的直系同源，這兩個(gè)CYP450酶可以相繼氧化labdane骨架上的C-20[44]。

人參皂苷(Ginsenoside)是一類四環(huán)三萜皂苷，主要分布在人參的根部。人參皂苷生物合成的第一步是2，3-氧化喹烯(2,3-Oxidosqualene)的環(huán)化，形成達(dá)瑪烯二醇(Dammarenediol-II)，由氧化喹烯環(huán)化酶組的達(dá)瑪烯二醇合酶(Dammarenediol Synthase，DDS)催化[57]。據(jù)報(bào)道，達(dá)瑪烷型三萜(Dammarane-type Triterpenoid)是人參皂苷的主要成分，具有原人參二醇(Protopanaxadiol)和原人參三醇(Protopanaxatriol)兩種不同的苷元結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)CYP450酶基因參與人參中達(dá)瑪烯型人參皂苷的生物合成，見圖2(淺綠色)。其中CYP716A47酶參與了Dammarenediol-II在C-12位的羥基化，生成Protopanaxadiol[45]。另一個(gè)酶CYP716A53v2參與Protopanaxadiol在C-6位的羥基化，產(chǎn)生Protopanaxatriol[58]。此外，三七中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與CYP716A53v2同源序列，起到同樣的催化作用[46]。CYP716A47和CYP716A53v2這兩個(gè)CYP450酶分別作為Dammarenediol C-12羥化酶和Protopana-xadiol C-6羥化酶參與了達(dá)瑪烷型人參皂苷的合成。CYP716A53v2的過表達(dá)和RNAi可以改變?nèi)藚⒃碥蘸康姆e累[59]。

甘草甜素(Glycyrrhizin)作為齊墩果烷型三萜(Oleanane-type Triterpenoid)的典型代表，在世界范圍內(nèi)被用作天然甜味劑和藥用材料。在甘草甜素合成途徑中，三萜類化合物的常見前體2,3-oxidosqualene最初環(huán)化為三萜骨架β-香樹脂醇(β-amylin)。CYP88D6基因編碼β-amyrin氧化酶(β-amyrin 11-oxidase)，其在體外和體內(nèi)被證明催化β-amyrin在C-11順序兩步氧化，產(chǎn)生11-氧代-β-香樹脂醇(11-oxo-β-amyrin)[47]，見圖2(綠色)。此外，11-oxo-β-amylin向甘草甜素的轉(zhuǎn)化還需要在C-30位進(jìn)一步氧化和C-3羥基的葡萄糖醛酸化。在甘草甜素等三萜皂苷生物合成的后期，三萜骨架的位點(diǎn)特異性氧化主要由CYP450酶催化。在鑒定了甘草甜素生物合成中最初的CYP450酶基因CYP88D6后[60]，CYP72A亞家族也被認(rèn)為參與了豆科植物中三萜皂苷的生物合成。CYP72A154能夠通過三個(gè)連續(xù)步驟氧化11-oxo-β-amyrin的C-30，產(chǎn)生甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)，一種甘草甜素苷元[48]。

綜上，CYP450酶家族廣泛參與了萜類化合物的合成并在其中扮演著重要作用；隨著技術(shù)手段的不斷發(fā)展與研究的深入，將會(huì)有越來越多CYP450酶被發(fā)現(xiàn)。目前，對(duì)CYP450酶的研究主要是構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫，從文庫中篩選出顯著差異的CYP450酶基因進(jìn)行組織特異性分析，隨后對(duì)其進(jìn)行功能分析。

3 CYP450酶的研究手段

3.1 基因的篩選

Eljounaidi等[61]利用花楸UniGene數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞Germacrene A氧化酶和廣木香內(nèi)酯合成酶，隨后通過同源檢索得到匹配度最高的同源物種洋薊中的CYP450基因CYP71AV9和CYP71BL5。由于CYP716家族的特征是參與特定的三萜或皂苷元生物合成，因此來自蒺藜苜蓿的CYP716A12被用于在黃花蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中篩選候選CYP450酶基因。結(jié)果，其中一個(gè)與CYP716A12相似度為63%的序列被注釋為CYP716A14v2，并最終被鑒定為功能性三萜氧化酶[62]。

根據(jù)植物組織或多因子誘導(dǎo)表達(dá)差異篩選。植物黃花蒿的倍半萜類物質(zhì)在其腺毛中分泌，因此Teoh等[39]為了鑒定與青蒿素生物合成相關(guān)的基因，從黃花蒿中分離腺毛，用作EST檢索的mRNA數(shù)據(jù)源，發(fā)現(xiàn)12個(gè)CYP71D亞家族基因。西洋參的重要成分人參皂苷主要在根部，根部組織特異性結(jié)合茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)表達(dá)模式分析更有助于鑒定參與人參皂苷生物合成的酶[63]。西洋參根轉(zhuǎn)錄組EST測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)150個(gè)序列被注釋為CYP450酶基因；結(jié)合MeJA誘導(dǎo)性上調(diào)進(jìn)一步縮小范圍，發(fā)現(xiàn)MeJA上調(diào)了6個(gè)CYP450酶基因，其中只有contig00248具有與Dammarenediol-II合酶相似的組織特異性表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)contig00248是催化達(dá)瑪烷或原人參二醇氧化的候選基因[63]。

3.2 CYP450酶基因表達(dá)與功能鑒定

基因表達(dá)和酶功能鑒定方式使用基因工程的多重手段。在篩選得到所需要的CYP450酶基因序列后，通過克隆或全合成手段得到DNA序列，與載體系統(tǒng)(病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體)的DNA組合成一個(gè)重組質(zhì)粒。這樣形成的重組質(zhì)粒可以先轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至大腸桿菌中，克隆和篩選出成功轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒的菌體，再?gòu)闹刑岢鲋亟M質(zhì)粒導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系(大腸桿菌、酵母或植物)，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，產(chǎn)生所需要的CYP450蛋白。原核(大腸桿菌)表達(dá)產(chǎn)生的蛋白可以純化后在體外加入底物分子共催化然后檢驗(yàn)是否有催化產(chǎn)物生成，或者不進(jìn)行蛋白純化，直接在真核系統(tǒng)(酵母或植物)中加入底物分子檢驗(yàn)酶的催化功能。例如，參與三萜合成的三個(gè)CYP716A亞家族基因CYP716A12、CYP716A15、CYP716A17使用了酵母表達(dá)體系鑒定[64]。CYP716A14v2通過在酵母和本氏煙草中表達(dá)，表征了其催化五環(huán)三萜的氧化，產(chǎn)生在C-3位羰基化的三萜的催化功能[62]。

3.3 異源合成與優(yōu)化

CYP450酶作用的發(fā)揮依靠宿主細(xì)胞中內(nèi)源性合成途徑、膜結(jié)合相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及大量遺傳工具如蛋白修飾酶、伴侶蛋白等。所以將原植物的CYP450轉(zhuǎn)入微生物系統(tǒng)中發(fā)揮作用存在許多挑戰(zhàn)。為了在有效成分的異源合成中提升產(chǎn)量，蛋白質(zhì)工程、氧化還原伴侶工程、底物工程及代謝工程等多種工程化改造手段相繼被應(yīng)用于P450酶的改造優(yōu)化[65]。Keasling等[66]設(shè)計(jì)了一條全新的青蒿酸合成途徑，將來自植物黃花蒿以及單細(xì)胞系統(tǒng)大腸桿菌、酵母中的多種基因精確組裝和調(diào)控，優(yōu)化表達(dá)，削弱酵母中FPP的支路途徑，表達(dá)來自黃花蒿的CYP71AV1,成功構(gòu)建了青蒿酸高產(chǎn)量達(dá)工程菌株。

4 討論與展望

多年來，合成生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了萜類代謝的研究，為生產(chǎn)高價(jià)值的萜類產(chǎn)品提供了工程平臺(tái)。然而，由于代謝和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜多樣性，植物萜類工程仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。但是青蒿素等萜類化合物合成的成功解析為接下來多種萜類化合物的生物合成探索提供了重要參考。CYP450酶在萜類生物合成中是復(fù)雜且至關(guān)重要的?？寺∷幬镙祁惿锖铣傻年P(guān)鍵CYP450酶基因?qū)τ谔烊簧a(chǎn)生物體和替代微生物的工程具有巨大的前景，以產(chǎn)生大量用于商業(yè)目的的目標(biāo)分子。

天然產(chǎn)物一直是藥物分子設(shè)計(jì)和開發(fā)過程中的重要靈感來源之一，源自天然產(chǎn)物的臨床用藥目前也占據(jù)著難以替代的地位。石斛堿及石斛堿類生物堿具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是這類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分離困難，利用傳統(tǒng)的化學(xué)合成和天然產(chǎn)物化學(xué)方法難以滿足日益增長(zhǎng)的研究需求和市場(chǎng)需求。石斛堿類生物堿作為中藥石斛特有的次生代謝產(chǎn)物和活性成分，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前報(bào)道的此類化合物只有31種，而僅中國(guó)石斛屬植物就有近80種。隨著提取和分離技術(shù)的進(jìn)步，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的化合物。目前對(duì)石斛堿類生物堿藥理活性的研究主要集中在總生物堿和石斛堿兩個(gè)方面。原因之一是通過傳統(tǒng)提取和分離方法獲得的其他生物堿的量非常少。如果石斛堿可以通過生物合成獲得，那么其他具有Picrotoxane結(jié)構(gòu)的石斛堿類生物堿可以通過后修飾獲得。后修飾CYP450酶的催化反應(yīng)對(duì)石斛堿類化合物最終結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要，其相關(guān)基因的功能研究鑒定有待進(jìn)一步探索。

作為酶底物的中間體的獲取也是一項(xiàng)難點(diǎn)，可以參考兩種解決辦法。一種是在構(gòu)建加入萜類前體FPP的Picrotoxane合酶合成體系，生產(chǎn)中間體；另一種是通過天然藥化手段從金釵石斛中提取得到Picrotoxane骨架的中間體化合物。后者由于天然產(chǎn)物分離過程的不確定性，可以建立課題組的中間體化合物庫，作為標(biāo)準(zhǔn)品建立化合物離子質(zhì)譜信息庫，建立組內(nèi)的代謝組學(xué)平臺(tái)用于檢測(cè)金釵石斛不同分離流分中的Picrotoxane類化合物含量，精準(zhǔn)分離以提高得率。本課題組將繼續(xù)探索石斛堿生物合成的構(gòu)建，通過克隆萜類合成酶基因、構(gòu)建酵母真核表達(dá)系統(tǒng)、加入分離的底物Picrotoxane型化合物等手段來解析石斛堿生物合成。

目前，已經(jīng)有石斛堿合成關(guān)聯(lián)CYP450酶基因通過金釵石斛轉(zhuǎn)錄組挖掘出來，下一步的方向是對(duì)這些相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)和功能驗(yàn)證。