河北中醫(yī)學(xué)院附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病科

陳曉婷 潘保朝△ 張 輝△ 蘇秀海 孫文娟 呂樹(shù)泉(滄州 061001)

提要 目的：研究健脾固腎化瘀湯對(duì)糖尿病腎臟病(DKD)大鼠腎臟病理變化的改善及腎病蛋白(Nephrin)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCp-1)和類(lèi)胰島素1號(hào)生長(zhǎng)因子(IGF-1)的影響。方法：采用雄性Sprague-Dawley大鼠腹腔注射鏈脲霉素(STZ)來(lái)復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)選擇6組，即正常組、模型組、雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組(1.9、3.8、7.6 g/kg)，各10只。用藥8周后，測(cè)定各組血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白的指標(biāo)。在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)學(xué)變化。用免疫組化法觀察Nephrin、MCp-1和IGF-1的表達(dá)，用RT-PCR方法觀察Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與正常組相比，模型組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1和IGF-1 mRNA的水平明顯升高(P<0.05)，Nephrin mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，健脾固腎化瘀湯各組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、MCp-1、IGF-1 mRNA水平下降(P<0.05)，Nephrin mRNA水平明顯提高(P<0.05)，且大鼠腎臟組織細(xì)胞排列整齊。結(jié)論：健脾固腎化瘀湯可下調(diào)IGF-1和MCp-1 mRNA的表達(dá)，上調(diào)Nephrin mRNA的表達(dá)，改善腎組織的病理變化，起到保護(hù)作用。

由于人口的老齡化程度逐漸加深，全球2型糖尿病的患病率在過(guò)去30年中迅速增加，這表明其微血管并發(fā)癥糖尿病腎臟病(DKD)的發(fā)病率也在迅速提高[1]。DKD為終末期腎病的主要病因，但DKD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前尚無(wú)特異性治療方法。西醫(yī)治療DKD的主要手段是通過(guò)藥物控制血壓、血脂和葡萄糖水平[2]，一些新的藥物如胰高糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑、鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑等能在一定程度上減少蛋白尿、改善腎功能進(jìn)而延緩DKD的進(jìn)展，但是也會(huì)產(chǎn)生胃腸道不適、低血糖、胰腺炎等副作用[3-4]。中醫(yī)藥因其多靶點(diǎn)、多組分、多環(huán)節(jié)、低毒副作用的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為改善DKD患者腎功能，阻止疾病進(jìn)展的重要治療手段。

健脾固腎化瘀湯是河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院依據(jù)中醫(yī)經(jīng)典理論結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)同時(shí)吸收名家經(jīng)典方劑形成，前期研究表明對(duì)DKD患者有良好的臨床效果[5]，但具體作用機(jī)制有待考證。本研究首先通過(guò)高脂飼料聯(lián)合鏈脲霉素(STZ)注射，建立DKD大鼠模型，明確健脾固腎化瘀湯對(duì)DKD大鼠的治療作用，其次通過(guò)RT-PCR、免疫組化等方法檢測(cè)健脾固腎化瘀湯干預(yù)后DKD大鼠腎臟組織中腎病蛋白(Nephrin)、單核細(xì)胞趨化因子1(MCp-1)、類(lèi)胰島素1號(hào)生長(zhǎng)因子(IGF-1)的表達(dá)情況，探究健脾固腎化瘀湯治療DKD的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 60只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量210～230 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供[動(dòng)物證書(shū)編號(hào)：11401300065459，單位許可證編號(hào)：SYXK(津)2014-0002]。標(biāo)準(zhǔn)正常飲食。所有動(dòng)物都被安置在一個(gè)溫度和濕度可控的環(huán)境中[12 h光/暗循環(huán)，(21±2)℃，相對(duì)濕度(45±10)%]，并允許自由采食和飲水。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒(Cat # 15596-026)；TIANScript RT KIT(Cat # KR104-02)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Cat # FP205)。

1.3 儀器 QL-902渦旋搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；5415D離心機(jī)(Eppendorf)；生物光度計(jì)(Eppendorf)；ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.4 藥品 健脾固腎化瘀湯由黃芪60 g，黨參10 g，黃精15 g，白術(shù)12 g，茯苓、山藥、芡實(shí)、金櫻子各15 g，山茱萸12 g，熟地黃15 g，當(dāng)歸12 g，川芎30 g，僵蠶、蟬蛻各10 g，水蛭6 g，酒大黃、淫羊藿各10 g組成。中藥是由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒，按比例加入純凈水制成懸浮液備用。雷米普利片(H200030724)，研末按比例加入純凈水制成懸浮液備用。

2 方法

2.1 分組與建模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組(簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組)，每組10只。正常組予常規(guī)飼料，其余50只給予高糖高脂飼料(10%豬油、20% 蔗糖、2.5% 膽固醇、67.5% 常規(guī)飼料)。特殊飼料喂養(yǎng)7周后于第7周末進(jìn)行腹腔注射STZ 30 mg/kg[以0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.4)配制成1%的STZ溶液]，注射前12 h禁食不禁水。72 h后尾靜脈采血檢測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，即可認(rèn)為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)1周，1周后開(kāi)始用代謝籠收集大鼠24 h尿，檢測(cè)24 h尿蛋白定量。以血糖水平≥16.7 mmol/L、尿白蛋白≥30 mg/24 h，作為DKD動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)[6]。

2.2 藥物干預(yù) 在造模成功后12 h開(kāi)始服藥。健脾固腎化瘀湯組用健脾固腎化瘀湯煎劑給藥，1次/d，2 mL/次，劑量按等效人體劑量計(jì)算。此外，雷米普利組作為陽(yáng)性對(duì)照[7]。健脾固腎化瘀湯分低、中、高劑量組使用，分別為1.9、3.8、7.6 g/kg, 健脾固腎化瘀湯中劑量組3.8 g/kg相當(dāng)于健脾固腎化瘀湯在人類(lèi)成人中的日用量，其計(jì)算公式如下：等效劑量(g/kg)=人類(lèi)粗制藥材的臨床用量(g/kg)×6.25。雷米普利組灌胃2 mL/次，1次/d(雷米普利粉末在正常生理鹽水中稀釋至0.001 g/kg[8])。正常組和模型組分別用相同劑量的正常生理鹽水胃內(nèi)注射，每天1次。各組干預(yù)持續(xù)8周。在此期間，大鼠自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食，環(huán)境溫度為(20±2)℃。沒(méi)有使用胰島素和其他降糖藥物。

2.3 樣本采集 治療8周后，所有大鼠存活，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，用毛細(xì)玻璃管從內(nèi)眥處采血。將采集的血液置于離心機(jī)中，以3 000 r/min的速度高速離心15 min，取上清液儲(chǔ)存于-80 ℃以備后用。在麻醉狀態(tài)下，通過(guò)頸椎脫位將大鼠處死，并立即從腹部取出雙側(cè)腎臟。部分腎臟組織被置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。其余的腎臟組織在-80 ℃下保存，以備將來(lái)使用。

2.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 取腎臟組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片。石蠟切片厚度為4 μm，然后進(jìn)行HE染色，顯色后在顯微鏡下觀察組織的病理變化。

2.5 生物化學(xué)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清尿素氮、肌酐、甘油三脂、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 RT-PCR法檢測(cè)腎皮質(zhì)Nephrin、MCp-1和IGF-1mRNA的表達(dá) RT-PCR對(duì)IGF-1 mRNA、Nephrin mRNA和MCp-1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照定量PCR儀的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每組10只大鼠進(jìn)行基因表達(dá)分析。腎臟中RNA的分離方法如下。(1)將組織樣本用研缽磨碎，放入離心管中，加入1 mL Trizol 5～10 min；(2)加入0.2 mL氯仿，上下劇烈攪拌15～30 s，然后靜置3 min(冰浴或室溫)；(3)4 ℃，12 000 r/min離心15 min；(4)取水相放入新的EP管，加入0.5 mL異丙醇，混勻，冰浴10 min；(5)4 ℃下12 000 r/min離心10 min；(6)倒出上層液體，沉淀物(1 mL)用75%冰乙醇，混勻；(7)4 ℃，12 000 r/min離心5 min；(8)干燥。加入DEPC處理水以溶解RNA，測(cè)量濃度，并在-80 ℃下保存。然后取5 μL RNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢查RNA的完整性。

依次加入2.5 μL稀釋10倍的PCR緩沖液，1.5 μL MgCl2 溶液，0.5 μL上游引物和下游引物，最后加水配成總體積25 μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系用DPEC水稀釋至50 μL，并保存在-20 ℃。最后，用熒光定量PCR儀進(jìn)行2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，計(jì)算各樣品靶基因的相對(duì)定量結(jié)果，即其他樣品靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于對(duì)照樣品的差異。

2.7 通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)腎臟中Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)情況 通過(guò)免疫組化染色評(píng)估腎臟中Nephrin、MCp-1和IGF-1的表達(dá)[9]。石蠟常規(guī)切片2～3 μm,脫蠟至水；PBS沖洗5 min×3次;檸檬酸鹽緩沖液中行抗原熱修復(fù)1 min 30 s,冷卻至常溫；PBS沖洗5 min×3次；分別滴加50～100 μL一抗兔抗大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1多抗,4 ℃過(guò)夜,同時(shí)用PBS代替一抗作陰性對(duì)照；次日用PBS洗3次,每次5～10 min;滴加50～100 μL山羊抗兔IgG-FITC,37 ℃,孵育40 min,避光；PBS(振搖)洗滌3次,每次10 min,避光；擦干,封片,4 ℃避光保存待測(cè);全自動(dòng)多功能熒光顯微鏡觀察,光學(xué)顯微鏡下觀察到腎組織棕黃色顆粒沉積為陽(yáng)性，用Image pro plus對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Nephrin、MCp-1和IGF-1在腎小球中表達(dá)。對(duì)Nephrin、MCp-1和IGF-1的蛋白質(zhì)相對(duì)水平進(jìn)行量化并與對(duì)照組進(jìn)行比較。記錄了20個(gè)隨機(jī)選擇的512×512像素、分辨率為0.4348 μm的彩色視頻圖像。根據(jù)RGB顏色參數(shù)觀察綜合光密度。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)后的肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平 干預(yù)8周后，與正常組相比，模型組大鼠的肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇、24 h尿白蛋白水平明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀煎劑低、中、高劑量組的甘油三酯、總膽固醇、肌酐、尿素氮和24 h尿白蛋白均明顯降低(P<0.05)；與雷米普利組相比，健脾固腎化瘀各組的肌酐、尿素氮、24 h尿白蛋白均明顯降低(P<0.05)，其中以中、高劑量組更為明顯，甘油三酯、總膽固醇降低但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)8周后的尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇和24 h尿白蛋白定量水平的變化

3.2 Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA在各組大鼠干預(yù)后的表達(dá)效果 干預(yù)8周后，與正常組相比，模型組IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而Nephrin mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組IGF-1 mRNA和MCp-1 mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，其中IGF-1 mRNA的表達(dá)以雷米普利組最為明顯，MCp-1 mRNA的表達(dá)以健脾固腎化瘀湯高劑量組最為明顯；雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組Nephrin mRNA的表達(dá)升高(P<0.05)，且以健脾固腎化瘀湯高劑量組更為明顯。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠干預(yù)8周后的Nephrin、MCp-1、IGF-1 mRNA表達(dá)水平

3.3 健脾固腎化瘀湯對(duì)大鼠Nephrin、MCp-1、IGF-1蛋白表達(dá)水平的影響 從圖1和表3可以看出，干預(yù)8周后模型組IGF-1和MCp-1蛋白的表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)，而Nephrin蛋白的表達(dá)則明顯低于正常組(P<0.05)。與模型組相比，雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組IGF-1和MCp-1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，其中IGF-1蛋白的表達(dá)以雷米普利組最為明顯，MCp-1蛋白的表達(dá)以健脾固腎化瘀湯高劑量組最為明顯；雷米普利組、健脾固腎化瘀湯低、中、高劑量組Nephrin 蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且以健脾固腎化瘀湯中、高劑量組更為明顯。

注：A.正常組；B.模型組；C.雷米普利組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組

表3 各組大鼠腎臟中Nephrin、MCp-1、IGF-1陽(yáng)性區(qū)域的綜合光密度(×103)

3.4 健脾固腎化瘀湯對(duì)大鼠腎臟組織病理變化的影響 從圖2可以看出，正常組的腎臟組織表現(xiàn)正常；模型組的腎臟組織細(xì)胞增生，細(xì)胞排列紊亂，腎小球內(nèi)的細(xì)胞減少；雷米普利組，健脾固腎化瘀煎劑低、中、高劑量組干預(yù)后，細(xì)胞排列整齊。

4 討論

DKD作為最令人擔(dān)憂的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，是指由糖尿病所致的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙的疾病，其病變可累及全腎(包括腎小球、腎小管、腎間質(zhì)等)。早期通常表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨后逐步進(jìn)展出現(xiàn)大量白蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降、血肌酐進(jìn)行性上升。如果不及時(shí)進(jìn)行治療，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重后果，最終發(fā)展為終末期腎衰竭[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在治療上往往從降糖、降壓、腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)阻斷、抗氧化、抗炎和改善微循環(huán)等方面多因素干預(yù)疾病[11]，雖有一定的效果，但大多只是對(duì)癥治療，延緩病情，并且在應(yīng)用如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)類(lèi)藥物時(shí)易引起干咳、升高血鉀等諸多不良反應(yīng)，不利于穩(wěn)定病情，所以說(shuō)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)仍缺乏有效藥物阻止病情發(fā)生發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)在治療DKD上歷史悠久，應(yīng)用廣泛，通過(guò)辨證論治和整體治療等方法，在治療DKD上有多靶點(diǎn)、多通路的優(yōu)勢(shì)。其中健脾固腎化瘀湯全方共奏健脾固腎、化瘀通絡(luò)之功。其中重用黃芪，以健脾益氣、消腫利尿，補(bǔ)諸虛不足；黨參健脾補(bǔ)氣；熟地黃、山茱萸、山藥、黃精均有補(bǔ)虛益腎之功；芡實(shí)、金櫻子固精益腎；白術(shù)益氣健脾，茯苓利水淡滲，兩者合用，能夠利水濕從小便去；當(dāng)歸養(yǎng)血活血；僵蠶、蟬蛻、水蛭用以化瘀通絡(luò)[12]。臨床研究中已經(jīng)證實(shí)健脾固腎化瘀湯可顯著改善DKD患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、膽固醇、甘油三酯、血壓、24 h尿微量白蛋白水平等[13]，但其作用機(jī)制尚不明確，探討其治療機(jī)制有利于進(jìn)一步應(yīng)用于臨床DKD患者，并為其提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

本項(xiàng)研究中，筆者利用高脂飼料聯(lián)合STZ注射制備大鼠的DKD模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中的尿素氮、甘油三酯和膽固醇以及尿液中的蛋白質(zhì)水平都有所上升。腎臟的HE染色顯示DKD模型大鼠的腎組織細(xì)胞過(guò)度增殖和排列紊亂，腎小球細(xì)胞減少，這與其他關(guān)于DKD的動(dòng)物研究一致[14]，表明造模成功。本研究結(jié)果顯示健脾固腎化瘀湯能夠改善模型大鼠的腎組織細(xì)胞，降低IGF-1蛋白和MCp-1蛋白的表達(dá)量，提高Nephrin蛋白的表達(dá)量，且呈現(xiàn)出劑量依賴的特征。

在糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究中，DKD發(fā)生發(fā)展與足細(xì)胞關(guān)系密切[15]。裂孔隔膜作為特有的足細(xì)胞間的細(xì)胞鏈接，是一種特殊的蛋白質(zhì)復(fù)合物，連接著相鄰的莢膜細(xì)胞足突，與DKD蛋白尿的產(chǎn)生密切相關(guān)。Nephrin作為裂孔隔膜上的特異性膜蛋白的一種，可通過(guò)正式或反式鏈接嗜異性結(jié)合，形成順勢(shì)異聚體，它的存在能夠使得裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)完整，功能正常[16]。眾多實(shí)驗(yàn)[17-18]已經(jīng)證實(shí)Nephrin對(duì)裂孔隔膜十分關(guān)鍵，同時(shí)Nephrin蛋白的減少也會(huì)對(duì)腎小球的硬化造成一定的影響[19]。在本研究中，模型組大鼠Nephrin蛋白表達(dá)減少，健脾固腎化瘀湯組大鼠在低、中、高劑量健脾固腎化瘀湯干預(yù)后，Nephrin蛋白的表達(dá)量的增加，能夠在一定程度上減輕DKD大鼠的腎臟損傷，延緩疾病的進(jìn)程。

炎癥反應(yīng)作為DKD的發(fā)病機(jī)制之一[20]，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。MCp-1作為一種C-C型趨化因子，MCp-1對(duì)單核細(xì)胞有特異的趨化激活作用，能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[21]。MCp-1是由腎小球系膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞進(jìn)行分泌，從而增加巨噬細(xì)胞黏附性，進(jìn)一步分泌致纖維化細(xì)胞因子并加重腎組織的損傷[22]。已有研究證實(shí)[23-25]，MCp-1的大量出現(xiàn)會(huì)使得腎臟功能受損，同時(shí)由于MCp-1在單核巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和激活中起著重要作用，會(huì)進(jìn)一步加重腎臟損傷。在本研究中，模型大鼠在服用健脾固腎化瘀湯后，MCp-1水平下降，抑制了腎臟中致纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)，降低了血管的通透性，改善了蛋白尿的情況。

IGF-1作為一種多肽神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有與胰島素相似的結(jié)構(gòu)和功能[26]。有研究已經(jīng)證實(shí)IGF-1水平升高與2型糖尿病患者腎臟病變損傷程度保持一致[27-28]，同時(shí)IGF-1作為一種新的血漿標(biāo)志物對(duì)于DKD早期診斷及疾病預(yù)后發(fā)展判定具有一定的臨床意義[29-30]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1可促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞產(chǎn)生層黏蛋白、纖維連接蛋白、膠原蛋白，使得腎小球硬化，加劇DKD的進(jìn)程[31]。本研究表明健脾固腎化瘀湯通過(guò)降血糖、改善腎小球微循環(huán)降低IGF-1含量，以改善腎小球的硬化，保護(hù)腎臟。

綜上所述，健脾固腎化瘀湯對(duì)DKD的腎臟有很好的改善和保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Nephrin mRNA、MCp-1、IGF-1的表達(dá)有關(guān)，為其臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。然而仍有不足，本研究只是在一定程度上揭示了健脾固腎化瘀湯治療DKD的作用機(jī)制，其具體的通路、靶點(diǎn)的研究仍是研究的重點(diǎn)方向。