張曉旭

(天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教研室， 天津 301617)

細(xì)胞生物學(xué)是生命科學(xué)、醫(yī)藥研究中的基礎(chǔ)學(xué)科，是一門(mén)應(yīng)用性、實(shí)踐性極強(qiáng)的學(xué)科。細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)是本科課程中極其重要的組成部分，有助于學(xué)生掌握細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)，訓(xùn)練科學(xué)研究技能，提升科學(xué)研究素養(yǎng)[1-4]。

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的合理設(shè)置對(duì)于充分發(fā)揮教學(xué)效果起著基石的作用。設(shè)置的課程內(nèi)容應(yīng)本著實(shí)驗(yàn)與理論相結(jié)合，讓學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中深化對(duì)理論知識(shí)的理解，同時(shí)要兼顧對(duì)學(xué)生醫(yī)學(xué)技能的培養(yǎng)，順應(yīng)科學(xué)發(fā)展的熱潮，不拘泥于傳統(tǒng)課程設(shè)置，時(shí)刻依據(jù)科學(xué)研究、臨床診斷等熱門(mén)需求對(duì)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行改進(jìn)[2]。

流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)細(xì)胞等小顆粒物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)的高速分析、分選，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)與醫(yī)藥領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，同時(shí)也應(yīng)用于疾病診斷，特別是血液癌變的分析[5-7]。因此，在本科教學(xué)中引入流式細(xì)胞術(shù)的教學(xué)對(duì)于學(xué)生而言，既能初步培養(yǎng)科研素養(yǎng)、提升科研分析能力，又能提前掌握科研或臨床應(yīng)用技能，為學(xué)生將來(lái)在科研及臨床中應(yīng)用該技術(shù)奠定了基礎(chǔ)[8]。

1 改革教學(xué)方法，將科研及臨床診斷實(shí)際需求融入教學(xué)

由于流式細(xì)胞術(shù)具有分辨率高、檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量大、參數(shù)多、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)，其在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)以及臨床檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。機(jī)體免疫狀態(tài)的檢測(cè)是臨床檢驗(yàn)中評(píng)價(jià)是否患病的重要指標(biāo)之一，可利用流式細(xì)胞術(shù)針對(duì)各種免疫細(xì)胞的形態(tài)及表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，確定各種免疫細(xì)胞的數(shù)量比例，從而幫助疾病診斷。例如，CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值在健康情況下接近2∶1，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中則偏高，而在感染HIV的患者體內(nèi)則偏低[9,10]。

我校在本科教學(xué)中充分考慮學(xué)生未來(lái)科研或工作中的實(shí)際所需，針對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)的未來(lái)所需不斷調(diào)整教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法，利用豐富全面的科研平臺(tái)為教學(xué)提供先進(jìn)的硬件基礎(chǔ)，利用演示與實(shí)際操作相結(jié)合的方式，讓學(xué)生提早接觸掌握科研及工作技能，培養(yǎng)科研興趣，提升科研素養(yǎng)，例如，對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)這一應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也將其有效融入本科教學(xué)。以往常見(jiàn)的對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞檢測(cè)DNA含量分析細(xì)胞周期的傳統(tǒng)課程在科研中應(yīng)用相對(duì)較少，且為單一標(biāo)志物，無(wú)法讓學(xué)生切身感受到利用多標(biāo)志物對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行分群的復(fù)雜情況。因此，我們調(diào)整了課程內(nèi)容，利用原代提取脾臟細(xì)胞讓學(xué)生接觸了解原代細(xì)胞的提取方法，利用細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群分析，標(biāo)志物的多樣性以及熒光的合理搭配使用可以給學(xué)生更多的自主選擇探索空間，讓學(xué)生更多接觸科研探索過(guò)程，避免了過(guò)去學(xué)生被動(dòng)接受單一選擇的問(wèn)題。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革目標(biāo)

2.1 知識(shí)與技能層面

學(xué)生掌握流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理，理清流式細(xì)胞儀的各種分析功能及其應(yīng)用；初步掌握利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分群的標(biāo)志物選擇原理和方法；了解原代分離細(xì)胞的各種方法及適用條件，明確脾臟中的細(xì)胞種類(lèi)。

2.2 過(guò)程與方法層面

學(xué)生能夠獨(dú)立分析脾臟提取時(shí)應(yīng)選用的原代細(xì)胞分離方法，并獨(dú)立提取小鼠脾臟中的淋巴細(xì)胞；結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)相關(guān)知識(shí)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)選擇可以區(qū)分小鼠脾臟T細(xì)胞與B細(xì)胞的標(biāo)志物；掌握流式樣品制備流程，初步學(xué)會(huì)使用功能簡(jiǎn)單的小型流式細(xì)胞分析儀(BD，Accuri C6 Plus)并了解參數(shù)設(shè)置原理以及細(xì)胞分群原理。

2.3 情感態(tài)度與價(jià)值觀層面

學(xué)生提高對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)科研創(chuàng)新意識(shí)和提出問(wèn)題并解決問(wèn)題的能力，由被動(dòng)接受學(xué)習(xí)變?yōu)橹鲃?dòng)解決問(wèn)題，激發(fā)自身的成就感[1,11]。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

脾臟是最大的外周免疫器官，內(nèi)含大量的T細(xì)胞和B細(xì)胞，是成熟淋巴細(xì)胞定居的場(chǎng)所，是淋巴細(xì)胞對(duì)血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所。CD19是B細(xì)胞受體(BCR)識(shí)別抗原過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)傳遞分子，也是B細(xì)胞表面特異性標(biāo)志，可作為免疫治療B細(xì)胞白血病的靶點(diǎn)。CD3是T細(xì)胞重要的膜蛋白，通過(guò)鹽橋與TCR形成TCR-CD3復(fù)合物，將TCR識(shí)別抗原產(chǎn)生的活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到T細(xì)胞內(nèi)。除CD19和CD3外，B細(xì)胞與T細(xì)胞還有很多其他重要膜分子，可供區(qū)分B/T細(xì)胞及其亞群[12,13]。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

儀器設(shè)備包括普通光學(xué)顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6 plus)。材料包括小鼠、解剖剪、解剖鑷、眼科剪、眼科鑷、35 mm培養(yǎng)皿、移液器、1 ml注射器、70 μm細(xì)胞過(guò)濾篩網(wǎng)、計(jì)數(shù)板、15 ml離心管。試劑包括PBS、紅細(xì)胞裂解液(ACK buffer)、脾臟緩沖液(29.22 mg EDTA加49.5 ml PBS緩沖液溶解，加入500 μl FBS)、單細(xì)胞重懸液(29.22 mg EDTA、0.25 g BSA加49.5 ml PBS緩沖液溶解)、4%多聚甲醛、FITC Anti-Mouse CD3 Antibody(Elabscience)、APC Anti-Mouse CD19 Antibody(Elabscience)、75%乙醇。

3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.3.1 脾細(xì)胞原代分離 ①取材。學(xué)生摘除眼球取血，頸椎脫臼處死，以75%乙醇對(duì)皮膚進(jìn)行表面消毒，解剖小鼠，分離脾臟，放入35 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入2 ml預(yù)冷的脾臟緩沖液備用；②去除脾臟組織上的結(jié)締組織或脂肪。學(xué)生離心管中加入5 ml單細(xì)胞重懸液，放一個(gè)70 μm細(xì)胞過(guò)濾器，將脾臟放于細(xì)胞篩中，剪開(kāi)一個(gè)小口，取干凈的注射器，用其按壓處的末端對(duì)組織以溫和畫(huà)圓的方式進(jìn)行碾壓。膜內(nèi)細(xì)胞會(huì)慢慢游離出來(lái)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞篩之后，懸浮在離心管中；用PBS清洗細(xì)胞篩，收集細(xì)胞篩外緩沖液，350 g離心15 min；③去上清。學(xué)生加紅細(xì)胞裂解液2 ml，重懸，冰上孵育4-5 min，偶爾搖晃，加8 ml PBS終止，350 g離心15 min，用PBS 5 ml再次清洗，350 g離心15 min除去上清；④單細(xì)胞重懸液重懸500 μl，除去其中不可溶的組織纖維。

3.3.2 流式樣品制備 ①取細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至106-107cells每毫升；②每份樣品吸取100 ul懸液至1.5 ml離心管中；③按表1分組避光加入抗體，4 ℃避光30 min；④加300 ul單細(xì)胞重懸液，混勻(若當(dāng)天無(wú)法上機(jī)，可加100 ul 4%多聚甲醛+200 ul單細(xì)胞重懸液，混勻后4 ℃保存)；⑤混勻細(xì)胞懸液過(guò)細(xì)胞篩，上機(jī)分析樣品。

表1 實(shí)驗(yàn)分組抗體添加情況

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

圖1為經(jīng)過(guò)抗體結(jié)合后的小鼠脾臟細(xì)胞。由FSC-A/SSC-A圖可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)機(jī)械碾壓法可獲得大量淋巴細(xì)胞；雖然樣品經(jīng)過(guò)了紅細(xì)胞裂解液的處理，但仍有很多紅細(xì)胞殘留，后續(xù)實(shí)驗(yàn)課可以對(duì)紅細(xì)胞裂解過(guò)程進(jìn)行調(diào)整，嘗試增加裂解時(shí)間；同時(shí)樣品中也存在較多的細(xì)胞碎片，可嘗試通過(guò)調(diào)整細(xì)胞離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間以及洗脫次數(shù)來(lái)改善。由FITC-A/APC-A圖可見(jiàn)，分離獲得的淋巴細(xì)胞中，T細(xì)胞占比約為17.6%，B細(xì)胞占比約為67.2%，與理論值T細(xì)胞40%，B細(xì)胞60%的占比仍有顯著的差異[12]。原因可能是通過(guò)FSC-A/SSC-A圖對(duì)淋巴細(xì)胞的選取并不精確，其中摻雜了其他細(xì)胞。同時(shí)可看出，通過(guò)機(jī)械碾壓的方法，對(duì)B細(xì)胞的獲取相對(duì)徹底，而T細(xì)胞則有較多無(wú)法分離獲取，這可能與脾臟中T細(xì)胞主要集中于PALS，而B(niǎo)細(xì)胞主要集中于PALS外側(cè)的脾小結(jié)有關(guān)[12]。

圖1 小鼠脾臟原代分離細(xì)胞流式分析結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革主要從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及教學(xué)方式上對(duì)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程進(jìn)行了改革。從實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上，本課程更加貼近學(xué)生未來(lái)的科研和工作需求，能夠更加深入地了解科研及臨床上利用率都很高的流式細(xì)胞儀的功能和應(yīng)用，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)不僅涉及細(xì)胞生物學(xué)的知識(shí)，也結(jié)合了免疫學(xué)相關(guān)的知識(shí)，讓學(xué)生充分感受了科研臨床上不同學(xué)科之間的交叉聯(lián)系。從教學(xué)方式上，我們給予學(xué)生更多思考的空間，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前引導(dǎo)學(xué)生思考分離獲取細(xì)胞的多種方法，從中選取最適合、最簡(jiǎn)便易行且有效的方法，同時(shí)引導(dǎo)學(xué)生結(jié)合免疫學(xué)中學(xué)到的相關(guān)知識(shí)分析思考實(shí)驗(yàn)中可能獲得哪些細(xì)胞，其中占主體會(huì)是哪些，確定能夠收集到大量淋巴細(xì)胞后，又對(duì)可以選擇哪些標(biāo)記蛋白來(lái)區(qū)分鑒定細(xì)胞進(jìn)行思考。

學(xué)生在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行了大量思考，也深入掌握了很多原本浮于書(shū)本的知識(shí)，明顯感受到學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性被調(diào)動(dòng)起來(lái)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，學(xué)生基本都能夠獨(dú)立完成，且獲得較好的結(jié)果。同時(shí)，由后續(xù)學(xué)生進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)療檢測(cè)機(jī)構(gòu)實(shí)習(xí)的反饋可知，本次實(shí)驗(yàn)課為學(xué)生的實(shí)習(xí)工作打下了良好的知識(shí)及技能基礎(chǔ)，真正實(shí)現(xiàn)了預(yù)期的教學(xué)效果。