劉青彥，張艷娜，宋智慧，呂文君

（河南省舞鋼市動物疫病預防控制中心，河南 舞鋼 462599）

高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒屬A 型流感病毒引起的以禽類為主的急性傳染病，禽流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白具有識別紅細胞表面受體并使紅細胞凝集的特性，因此，禽流感抗體可以通過HA/HI（血凝/血凝抑制）試驗來檢測。筆者在多年的檢測工作中分析了一系列影響HA/HI 試驗結(jié)果準確性的因素?，F(xiàn)將這些因素加以總結(jié)，概述如下，希望為從事獸醫(yī)實驗室檢測的從業(yè)者提供參考。

1 影響HA/HI試驗結(jié)果準確性的因素分析

1.1 待檢樣品不合格

樣品在采集、運輸、保存等環(huán)節(jié)疏漏，導致樣品腐敗、溶血被污染或樣品編號弄混。

1.2 PBS液不合格

PBS液pH值在7.2時紅細胞沉降最好，所以PBS液一定要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH 值至7.2。PBS 液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，通常以新開啟的生理鹽水代替PBS 液，也基本可避免這些情況。

1.3 1%紅細胞不合格

①1%紅細胞并非來自未經(jīng)免疫的健康公雞；②制作1%紅細胞的某一環(huán)節(jié)（采集、洗滌過程中或盛裝容器不干凈）被污染造成非特異性免疫，影響試驗結(jié)果；③紅細胞在洗滌過程中，離心機轉(zhuǎn)速設置過高，導致紅細胞因強大離心力而被壓擠破壞；④配制1%紅細胞時把本該用的PBS液錯用成蒸餾水，導致紅細胞因滲透壓差而崩解破壞。

1.4 HA試驗操作不當?shù)葘е驴乖r測定不準確

①滴加抗原到反應板上時滴頭未潤濕導致抗原效價偏低，從而導致測得結(jié)果偏高；②滴頭深入抗原液面下過深，抗原倍比稀釋時又未更換滴頭，從而導致測得抗原效價偏高，因而測得待檢血清抗體偏低；③在抗原倍比稀釋過程中移液器未插入液面下，導致氣泡產(chǎn)生；④1%紅細胞不合格；⑤已測過效價的抗原再次使用時直接按原來的效價配制4單位抗原，導致4單位抗原濃度偏低，從而使測得抗體效價偏高（每次試驗都需重新測定抗原效價）；⑥滴加紅細胞前未將其搖勻；⑦反應時間過短，結(jié)果出現(xiàn)太慢，或反應時間太長，或溫度太高導致紅細胞解凝，影響結(jié)果觀察（溫度最好控制在20～25 ℃，反應時間在30 min左右）。

1.5 計算錯誤導致所配4HAU抗原不準

雖然測得的抗原效價準確，但因計算錯誤或者雖計算正確但配制環(huán)節(jié)中出錯都可能導致所配制的4HAU 抗原不準。

1.6 HI試驗過程操作不當?shù)确矫嬖?/h3>

①因血清倍比稀釋過程中滴頭未插入液面下導致氣泡產(chǎn)生或吹吸次數(shù)過少，混合不均勻；②血清倍比稀釋過程中因用多道移液器未注意到個別滴頭是否松動導致吸液量不夠，或者樣品呈果凍樣無法吸取；③滴加4HAU 抗原時因操作不熟練導致跳孔、串孔及液滴兒飛濺；④再加另一種樣品時未更換滴頭；⑤滴加4HAU 抗原或紅細胞后未立即震蕩混勻，或震蕩時間過長；⑥未按操作規(guī)程，導致加樣順序錯誤（即滴加抗原和滴加紅細胞順序顛倒）；⑦滴加紅細胞前未將其搖勻；⑧反應時間過長或溫度過高導致已凝集的紅細胞解凝。

2 糾正措施

進行4HAU抗原校正，其方法如下：①在反應板的1～4孔內(nèi)加入25 ul的生理鹽水；②吸取25 ul 4HAU抗原加入第一孔，然后倍比稀釋到第4孔；③再吸入25 ul 1%雞紅細胞懸液依次加入1～4 孔；④在微量振蕩器上振蕩1 min，混合均勻；⑤室溫靜置30 min后觀察結(jié)果；⑥結(jié)果觀察：第1孔、第2孔完全凝集，第3孔紅細胞50%沉淀，第4孔完全沉淀，說明所配4HAU 抗原準確，校正成立。但如果出現(xiàn)第2 孔紅細胞50%沉淀，則說明所配的4HAU 抗原濃度低一倍，這時需再向所配的4HAU抗原溶液中添加一倍量的抗原。如果出現(xiàn)第4 孔紅細胞50%沉淀，則說明所配的4HAU 抗原濃度高一倍，這時需再向所配的4HAU 抗原溶液中添加一倍量的PBS液，不過這可能導致4HAU配得太多而造成浪費。一般建議先少量配制，根據(jù)校正結(jié)果再適量配制。4HAU抗原校正可謂是驗證所配4HAU（濃度）是否準確的“定海神針”?！?/p>