強(qiáng) 鄭，周心怡，吳曉媚，馮家成

（1.珠海市婦幼保健院病理科，廣東珠海 519000；2.珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519000）

提要：未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）是在病理因素刺激下，由于錯(cuò)誤蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞核減少蛋白合成以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的保護(hù)措施。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是溶酶體特異性選擇降解受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的代謝過程。UPR 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的表達(dá)關(guān)系可以是協(xié)同，亦可是拮抗，更重要的是，將UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬調(diào)節(jié)至正常水平范圍內(nèi)，這將更有利于心肌細(xì)胞生存。本文將概述未折疊蛋白反應(yīng)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）中的研究進(jìn)展。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)精細(xì)的膜系統(tǒng)，占細(xì)胞總膜面積的50%，其由一個(gè)連續(xù)的膜囊和膜管網(wǎng)組成，可包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它們均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連續(xù)結(jié)構(gòu)的一部分［1］。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因表面附著有核糖體顆粒而得名，其主要與外輸性蛋白的合成加工有關(guān)，多存在于具有分泌肽類激素的細(xì)胞中；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面無核糖體附著，其在不同細(xì)胞的不同時(shí)期的結(jié)構(gòu)、數(shù)量、分布及功能特性都各不相同，例如在心肌細(xì)胞中特化的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，稱為肌質(zhì)網(wǎng)，可儲存及釋放鈣離子調(diào)節(jié)肌肉收縮［2］。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常運(yùn)行是保證細(xì)胞內(nèi)蛋白、脂類等合成加工以及鈣離子平衡等功能的重要前提，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到病理刺激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)及功能會(huì)發(fā)生紊亂，這稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［3］，它會(huì)誘發(fā)相應(yīng)補(bǔ)救措施協(xié)助其緩解壓力，補(bǔ)救措施主要包括三大類反應(yīng)：（1）未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）；（2）正確折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度蓄積激活核因子Kappa B 引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負(fù)荷反應(yīng)；（3）膽固醇缺乏誘導(dǎo)釋放固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白-固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatorv element bingding proteins，SREBP）復(fù)合物引發(fā)的膽固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)；其中，UPR 發(fā)揮著主導(dǎo)作用，其負(fù)責(zé)將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號傳遞至細(xì)胞核，細(xì)胞核降低蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力［4］。更重要的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號在誘導(dǎo)UPR 的同時(shí)，也會(huì)激活自噬信號通路形成自噬小體包裹受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解和再利用，以保證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常代謝，這種特異性的選擇自噬過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬［5］。

1 未折疊蛋白反應(yīng)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心血管疾病中的作用機(jī)制

1.1 心肌梗死

Jiang 等［6］通過手術(shù)結(jié)扎C57BL/6 小鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支，模擬建立急性心肌梗死動(dòng)物模，檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心肌組織中血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏連蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。此外，在急性心肌梗死后增生的血管中檢測發(fā)現(xiàn)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regu?lated protein 78，GRP78）和微血管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（mi?crotubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、BECLIN-1的表達(dá)明顯上調(diào)。隨后，為深入了解心肌梗死后血管生成機(jī)制，在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行缺氧處理并過表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor-a，VEGF-A），檢測發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，ATG）4、ATG5、LC3、BECLIN-1 的表達(dá)明顯上調(diào)，且需肌醇酶l（inositol-requiring kinase 1，IRE1）、GRP78 的表達(dá)明顯上調(diào)，另外，利用自噬抑制劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)IRE1、GRP78 的表達(dá)明顯下調(diào)，而利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；切苋パ跄懰岣深A(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、BECLIN-1 的表達(dá)明顯下調(diào)。由此可知，上調(diào)UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平可以促進(jìn)心肌梗死后血管的生成。

1.2 心肌缺血再灌注損傷

Chang 等［7］通過提取Sprague-Dawley 大鼠原代心肌細(xì)胞，并間斷缺氧孵化器培養(yǎng)處理，模擬建立心肌細(xì)胞缺氧再灌注損傷模型，檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中GRP78、C/EBP 的同源蛋白（CCAAT enhancer binding protein homologous protein，CHOP）的表達(dá)明顯下調(diào)，而LC3 的表達(dá)明顯上調(diào)，且免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)自噬小體明顯增加。此外，利用3-MA干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)GRP78、CHOP、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，EIF2α）、IRE1、活化轉(zhuǎn)錄因子（activat?ing transcription factor，ATF）4、ATF6 的表達(dá)明顯上調(diào)。與此同時(shí)，將C57BL/6 小鼠飼養(yǎng)在間斷缺氧培養(yǎng)箱中，模擬建立心肌缺血再灌注損傷模型，檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中LC3 的表達(dá)明顯上調(diào)，而其GRP78、CHOP 的表達(dá)明顯下調(diào)。另外，在給實(shí)驗(yàn)組小鼠喂養(yǎng)3-MA 干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)其GRP78、CHOP 的表達(dá)明顯上調(diào)。由此可知，在心肌缺血再灌注損傷時(shí)，可以適應(yīng)性增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平，進(jìn)而減少UPR。

1.3 心力衰竭

Li 等［8］在Sprague-Dawley 大鼠皮下注射β1 腎上腺素受體抗原肽，模擬建立心力衰竭模型，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、BE?CLIN-1 的表達(dá)明顯下調(diào)，而選擇性自噬底物的表達(dá)明顯上調(diào)，GRP78 的表達(dá)明顯上調(diào)。與此同時(shí)，利用β1 腎上腺素受體抗體刺激H9c2 大鼠心肌細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)其LC3 的表達(dá)明顯下調(diào)，而GRP78、CHOP 的表達(dá)明顯上調(diào)。另外，在實(shí)驗(yàn)組加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸鈉鹽干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、BECLIN-1 的表達(dá)明顯上調(diào)，而P62 的表達(dá)明顯下調(diào)。由此可知，在β1-AA 誘導(dǎo)的心力衰竭中，適應(yīng)性上調(diào)UPR 抑制自噬過度清除受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

1.4 心肌肥大

Xie 等［9］通過培養(yǎng)H9c2 大鼠心肌細(xì)胞，利用人牛吡啶（APELIN-13）誘導(dǎo)心肌肥大模型，檢測發(fā)現(xiàn)其GRP78、CHOP 和LC3、BECLIN-1 的表達(dá)明顯上調(diào)，透視電鏡下觀察到受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和自噬小體明顯增多。此外，在實(shí)驗(yàn)組分別加入GRP78 和CHOP 抑制劑干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠LC3、BECLIN-1 的表達(dá)均明顯下調(diào)，更重要的是，干預(yù)組大鼠中的心肌肥大標(biāo)志物腦鈉肽的表達(dá)明顯下調(diào)。由此可知，在人牛吡啶誘導(dǎo)的心肌肥大中UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬水平被過度激活，有效地減少UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬將有利于人牛吡啶誘導(dǎo)的心肌肥大。

1.5 心律失常

Marit 等［10］通過培養(yǎng)HL-1 心房細(xì)胞，并利用頻率刺激器模擬心房顫動(dòng)頻率，建立心房細(xì)胞心房顫模型，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、ATG12 的表達(dá)明顯上調(diào)，而P62 的表達(dá)明顯下調(diào)，且透視電鏡下觀察到自噬小體明顯增多，隨后，檢測還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中EIF2α、ATF4、ATF6、CHOP 的表達(dá)明顯上調(diào)，且透視電鏡下觀察到受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多。為深入研究UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心房顫動(dòng)中的作用機(jī)制，利用4-PBA干預(yù)實(shí)驗(yàn)組之后，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、ATG12 的表達(dá)明顯下調(diào)，而P62 的表達(dá)明顯上調(diào)。與此同時(shí)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過口服三磷酸腺苷溶液喂養(yǎng)狗建立心房顫動(dòng)模型，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、ATG12 和ATF6、CHOP 的表達(dá)明顯上調(diào)，另外，口服4-PBA 溶液干預(yù)之后，檢測發(fā)現(xiàn)LC3、ATG12 的表達(dá)明顯下調(diào)，而P62 表達(dá)明顯上調(diào)，更重要的是，干預(yù)組心房動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間明顯縮短、L-型鈣離子通道電流明顯減少以及心房重構(gòu)明顯改善。由此可知，UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心房顫動(dòng)模型中被明顯激活，有效地抑制UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬將有助于心房重構(gòu)。

1.6 肥胖型心肌病

Hsu 等［11］利用高脂飼養(yǎng)C57BL/6 小鼠，16 周后檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血脂、血糖均明顯增高，并心肌損傷標(biāo)志物肌鈣蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，此外，LC3 的表達(dá)明顯上調(diào)，而蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endo?plasmic reticulum kinase，PERK）的表達(dá)明顯下調(diào)。由此可知，UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在高脂誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮著重要作用，但其機(jī)制需要深入研究。

2 總結(jié)

UPR 是在病理因素刺激下，由于錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集誘導(dǎo)細(xì)胞核減少蛋白合成以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的保護(hù)措施，其主要涉及3 條信號通路，分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE1 和ATF6 有關(guān)，在生理狀態(tài)下GRP78 分別和PERK、IRE1、ATF6 形成穩(wěn)定復(fù)合物［12］，而在應(yīng)激狀態(tài)下GRP78 分別和PERK、IRE1、ATF6 解離，形成PERK-eIF2α、IRE1-X-盒結(jié)合蛋白1（X box-binding protein 1，XBP1）和ATF6-ERSE 三條信號通路，其中，（1）PERK-eIF2α 信號通路能抑制翻譯起始復(fù)合物中鳥嘌呤二核苷酸磷酸（GDP）與鳥嘌呤三核苷酸磷酸（GTP）的交換，阻斷翻譯起始復(fù)合物eIF2α-GTP-tRNAMet 的組裝，減少蛋白的翻譯與合成；（2）IRE1-XBP1 信號通路可以結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件的基因啟動(dòng)子，誘導(dǎo)CHOP、GRP78 等分子伴侶和蛋白降解酶的表達(dá)，加快蛋白折疊和錯(cuò)誤蛋白降解；（3）ATF6-ERSE 信號通路可以誘導(dǎo)含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件的基因啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄［13］。最新研究發(fā)現(xiàn)，UPR 不僅僅在心血管疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，在結(jié)腸炎、糖尿病腎病、腦缺血、骨肉瘤和肝癌等非心血管疾病中也起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)功能［14-18］。

自噬是一種高度保守的分解代謝過程，由溶酶體清除受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤蛋白，并將其產(chǎn)物循環(huán)利用來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其在細(xì)胞器周轉(zhuǎn)中起著關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞的生長發(fā)育，維持細(xì)胞代謝平衡，是細(xì)胞生存必不可少的代謝過程。自噬分為3 種形式：微自噬、大自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，它們的細(xì)胞功能和靶點(diǎn)傳遞給溶酶體的方式各不相同［19］。目前，研究最多的形式是大自噬，其分為4 個(gè)步驟：（1）細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號；（2）脂質(zhì)形成孤立自噬小體；（3）自噬小體延伸包裹目標(biāo)內(nèi)容物；（4）溶酶體識別并降解自噬小體［20］。以往研究認(rèn)為，自噬是一個(gè)非特異性地降解受傷細(xì)胞器和錯(cuò)誤蛋白的過程，但是，Bernales 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在衣霉素誘導(dǎo)酵母發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，電子顯微鏡下觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)小囊泡，該囊泡被證實(shí)為只含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自噬小體，因此，該囊泡形成和降解的過程被稱為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬”，更重要的是，這也證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬是一個(gè)具有特異選擇性的代謝過程，其主要的分子過程：（1）在應(yīng)激狀態(tài)下，通過mTOR 途徑激活ULKATG13-FIP200-ATG101 復(fù)合物，誘導(dǎo)自噬起始；（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和DFCP1 形成歐米伽體，同時(shí)，ATG13 誘導(dǎo)ATG14-VPS34-BECLIN-1 復(fù)合體作為原料；（3）歐米伽體和ATG5-ATG12-ATG16L 復(fù)合物結(jié)合形成自噬小體；（4）自噬小體延伸包裹受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并和ATG5-ATG12-ATG16L 復(fù)合物解離；（5）溶酶體通過識別自噬小體膜上LC3 II，降解自噬小體［22］。

綜上所述，UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在正常心肌細(xì)胞代謝中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能，同時(shí)，也是心肌細(xì)胞生存必不可少的代謝過程，在生理狀態(tài)下，基礎(chǔ)水平的UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可以被視為保護(hù)作用，它們分別通過減少錯(cuò)誤蛋白合成和降解受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來促進(jìn)心肌細(xì)胞生存。值得一提的是，在應(yīng)激狀態(tài)下，不在基礎(chǔ)水平范圍內(nèi)的UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬又可被視為損害作用，其一，過度水平的UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞的蛋白合成不足和細(xì)胞器過度降解，使得心肌細(xì)胞缺乏蛋白和細(xì)胞器［23-24］；其二，過低水平的UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬可以導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白聚集和受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)殘留，使得心肌細(xì)胞的代謝失衡［25-26］。但是，通過以上研究結(jié)果，我們不難發(fā)現(xiàn)在心血管疾病中，UPR 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的表達(dá)并非一致，二者可以是協(xié)同關(guān)系，亦可是拮抗關(guān)系，因此，明確UPR 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬的在心血管疾病中的表達(dá)關(guān)系是非常關(guān)鍵的，更重要的是，將UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬調(diào)節(jié)至正常水平范圍內(nèi)，這將更有利于心肌細(xì)胞生存。但是，就目前的報(bào)道來說，有關(guān)UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心血管疾病中的研究還是相對缺乏，個(gè)別心血管疾病甚至還沒有相關(guān)研究報(bào)道，因此，探討UPR-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬在心血管疾病中的作用機(jī)制也可以作為未來研究的方向之一。