陳馨蕊 趙小玉 李淑英 曹 鵬 楊 華* 姚小梅

1.天津醫(yī)科大學(xué)(300070)；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院

1 臨床資料

女，31歲，孕2產(chǎn)0?；颊咄＝?jīng)2月余，無明顯誘因腹痛伴陰道出血1d入院。婦科檢查見子宮增大如孕50d，雙附件未及明顯異常。B超檢查示提示，宮內(nèi)早孕，孕卵停育，先兆流產(chǎn)?；颊呋楹?年，自然妊娠2次，第1次為16個月前出現(xiàn)生化流產(chǎn)?；颊呒韧w健，平素月經(jīng)規(guī)律，有痛經(jīng)史，否認遺傳家族史。入院后行人工流產(chǎn)術(shù)。妊娠期間人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)正常，術(shù)前末次檢測為69 574 U/L。甲狀腺功能檢查均正常(血清游離三碘甲狀原氨酸(FT3)4.7pmol/L；血清游離甲狀腺激素(FT4)12.6 pmol/L；促甲狀腺激素(TSH)1.986mU/L；甲狀腺球蛋白抗體1.9 U/ml。空腹血糖正常，弓形蟲抗體TOX-IgG、風(fēng)疹病毒抗體RV-IgG、巨細胞病毒抗體CMV-IgG、單純皰疹病毒HSV-II-IgG 、滴蟲檢查、霉菌檢查均陰性。

經(jīng)患者同意并簽署知情同意書后，取患者流產(chǎn)絨毛組織提取DNA，并使用Illumina高通量測序平臺(HiSeq/MiSeq)進行全外顯子測序。數(shù)據(jù)分析：獲得的有效測序數(shù)據(jù)，通過BWA(Li H et al.) 和Samblaster比對到參考基因組(B37)，獲得SNP位點信息，并利用ANNOVAR(Wang K et al.)軟件對SNP位點進行注釋，包括SNP位點的基因結(jié)構(gòu)注釋、基因組特征注釋、非同義突變有害性預(yù)測、已知變異數(shù)據(jù)庫注釋、變異相關(guān)基因功能注釋。最終得到了22423個SNP位點和1458個InDel位點。對甲狀腺激素受體(THR)分析，發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素受體α基因在染色體17(17q21.1)有4個SNPs位點(rs1402030G>C、rs67228062T>A、rs939348T>C、rs9893741T>C)，THRB在染色體3(3p24.2)有7個SNPs位點(rs138578441CT>C、rs142996757G>GTTTCCTTTCATTTCC、rs1667743C>A、rs1667765T>C、rs372912060C>T、rs3836253G>GA、rs7642896G>C)，均位于內(nèi)含子區(qū)域。除THR外，與甲狀腺激素合成相關(guān)的基因：促甲狀腺激素受體(TSHR)基因存在13個多態(tài)位點，其中3個位于外顯子區(qū)域SNPs位點(c.A696G:p.L232L、c.C742A:p.R248S、c.G2181C:p.E727D)；甲狀腺過氧化物酶(TPO)基因存在36個SNPs位點，其中7個位于外顯子區(qū)域SNPs位點(c.C12G:p.L4L、c.G1117T:p.A373S、c.G1193C:p.S398T、c.C1998T:p.D666D、c.C2145T:p.P715P、c.A2173C:p.T725P、c.T2408C:p.V803A)。雙氧化酶2(DUOX2)基因存在5個SNPs位點，其中3個位于外顯子區(qū)域SNPs位點(c.C3200T:p.S1067L、c.G1461C:p.G487G、c.C413T:p.P138L)。DUOXA2基因存在1個位于外顯子區(qū)域SNPs位點(c.C298G:p.R100G)。TRHR基因存在1個位于內(nèi)含子區(qū)域SNPs位點。未發(fā)現(xiàn)TTF-1、TTF-2、PAX8、NIS基因SNPs位點。為了進一步探討此例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛甲狀腺激素受體蛋白的表達，將此例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)病例的絨毛與15例非RSA病例進行了流產(chǎn)絨毛的免疫組化染色與Western-blotting分析比較。發(fā)現(xiàn)THRβ1主要在胎盤絨毛基底膜上的細胞滋養(yǎng)層細胞(CT)表達，而位于表面的合體滋養(yǎng)層細胞(ST)表達較少，與非RSA患者相比，unexplained RSA患者THRβ1在胎盤絨毛中的CT以及ST表達均顯著下降(P<0.05)。Western-blotting 獲得的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。

2 討論

Li等[1]對于中國漢族人群進行研究，研究包括200名不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者和200名正常對照。通過對其流產(chǎn)絨毛組織進行測序發(fā)現(xiàn)miR-10a(非編碼小RNA，通過堿基對對目標(biāo)mRNA的部分互補位點進行降解或翻譯抑制調(diào)控基因表達)位點上出現(xiàn)的rs3809783 A>T的多態(tài)改變通過破壞成熟miR-10a的產(chǎn)生，促進復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的遺傳易感性。Abdollahi等[2]對200名復(fù)RSA患者及200名健康對照的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者的IL-23受體(R381Q)SNPs頻率較正常對照組低。Arjmand等[3]的病例對照(病例組117個，對照組117個)研究顯示，位于HLA-G基因(人類白細胞抗原-G，屬于人類一種非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合體，選擇性高表達于侵入子宮蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細胞)上的SNP HLA-G*0105N可以通過與其他基因組件的連鎖不平衡導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。Fan等[4]對1284位中國漢族RSA患者的胎盤絨毛進行測序，并與1046正常對照(至少成功妊娠1次)進行對比，發(fā)現(xiàn)CLTA-4/Foxp3基因多態(tài)(rs231775 A>G, rs3087243 G>A, rs2232365 A>G, rs2232368 G>A)與RSA的發(fā)生有關(guān)。全外顯子測序(WES)在RSA病因研究中應(yīng)用廣泛。研究表明，有2/3的早期胚胎異常和1/3的胎兒異常與染色體異常有關(guān)[5]。Filges等[6]對1名有家族遺傳傾向的RSA孕婦患者(G18P0，均為自然流產(chǎn)，其母G20P2)胎盤絨毛組織進行全外顯子測序。WES顯示在這個家庭中存在PLCD4(磷脂酶C δ4)(2,219501020,1,T/C)和OSBPL5(羥甾醇結(jié)合蛋白5)(11,3123481,1,C/G)基因SNP位點，這與卵母細胞成熟、活化和受精過程有關(guān)。

本例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)測序發(fā)現(xiàn)TSHR、TPO、DUOX2及DUOXA2的多態(tài)性可能導(dǎo)致胎兒甲狀腺發(fā)育異?；蚣谞钕偌に睾铣烧系K。TSHR在外顯子區(qū)域SNPs有3個位點，編碼TSHR的基因位于14號染色體長臂上(14q31)，其中c.A696G:p.L232L、c.C742A:p.R248S在OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)中提示，不排除與自身免疫性甲狀腺功能亢進，非自身免疫性甲狀腺功能亢進，甲狀腺功能減退及先天性甲狀腺功能減低有關(guān)。TSHR基因編碼的蛋白對于甲狀腺細胞的增殖分化以及功能有重要影響，在甲狀腺形態(tài)發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

本例RSA測序發(fā)現(xiàn)TPO基因在外顯子處有7個SNPs位點，編碼TPO的基因位于2號染色體短臂上(2p25)，TPO基因多態(tài)性引起的遺傳缺陷可導(dǎo)致人群中的甲狀腺功能障礙，也是導(dǎo)致先天性甲狀腺功能減低的因素，對于胎兒則會影響甲狀腺的發(fā)育和中晚期甲狀腺激素的合成。編碼的甲狀腺過氧化物酶主要負責(zé)碘化物氧化、有機化作用和碘化酪氨酸連接[7]。其中c.A2173C:p.T725P是與成年甲狀腺功能減退癥高度相關(guān)的等位基因，而攜帶c.C1998T:p.D666D等位基因的人群患甲狀腺功能減退癥的風(fēng)險下降[8]。在我國c.C1998T:p.D666D、c.C12G:p.L4L、c.T2408C:p.V803A位點的等位基因及基因型頻率分布，在先天性甲狀腺功能減退癥患兒和健康兒童間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認為可能不是先天性甲狀腺功能低下的主要致病基因[9]。本例發(fā)現(xiàn)的位于外顯子的c.G1117T:p.A373S、c.G1193C:p.S398T、c.C2145T:p.P715P多態(tài)尚未見報道。

筆者發(fā)現(xiàn)3個DUOX2位于外顯子區(qū)域的SNPs位點，編碼DUOX2基因位于15號染色體長臂上(15q15.3)，長度為22kb，是甲狀腺激素碘有機化過程中的重要調(diào)控基因[10]；編碼DUOXA2基因位于15號染色體長臂上(15q21.1)，DUOXA2基因突變被認為是先天性甲狀腺功能減退癥患兒的可疑致病因子[11]，DUOX2/DUOXA2在甲狀腺的發(fā)育中起到重要作用，其異常會影響H2O2的合成，進而影響TPO的碘有機化過程，從而導(dǎo)致甲狀腺激素合成障礙[12]。其中c.C413T:p.P138L被認為和永久性的甲狀腺功能減退癥有關(guān)[13]；c.C413T:p.P138L及c.C3200T:p.S1067L在先天性甲狀腺功能減退癥患者中出現(xiàn)的頻率高于正常人群[14]。c.G1461C:p.G487G為可疑致病突變[15]。雖然本例測序發(fā)現(xiàn)的第3個SNPs位點rs2576090尚未見報道，但不能排除其對甲狀腺發(fā)育及功能的影響。

雖然本例RSA病例發(fā)現(xiàn)THRA和THRB上的SNPs位點均位于內(nèi)含子區(qū)域，并不能產(chǎn)生功能性蛋白，但不能因此除外其通過調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄等過程影響功能。Hayashi[16]在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，rs1050606位點的等位基因頻率在RSA患者和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義；且首次運用該多態(tài)性位點來評估RSA患者的妊娠結(jié)局。另外有研究者應(yīng)用垂體細胞系的體外研究定義了THRB2亞型中的基礎(chǔ)啟動子區(qū)域。在評估啟動子在體內(nèi)的功能時，Jones等[17]發(fā)現(xiàn)了一個保守的有600堿基對的內(nèi)含子區(qū)域，它起著增強子的作用，改變了垂體和視網(wǎng)膜細胞中THRB2亞型的表達。Alberobello等[18]證實了這個內(nèi)含子增強子區(qū)域(ICR)的多態(tài)性可以調(diào)節(jié)突變的THRB等位基因的垂體表達，從而影響臨床表現(xiàn)。2011年N Engl J Med報道，甲狀腺激素水平在正常臨界值的6歲兒童，出現(xiàn)甲狀腺功能減退癥狀(發(fā)育遲緩，骨骼發(fā)育不良等)，生長發(fā)育明顯落后于同齡人群，通過基因測序及基因多態(tài)性功能分析，發(fā)現(xiàn)THRA基因存在無義突變(c1207 G→T, p.E403X)，該突變可產(chǎn)生抑制野生型受體作用的突變蛋白，導(dǎo)致患者出現(xiàn)甲狀腺功能減退癥狀，從而導(dǎo)致患者發(fā)育遲緩[19]。在妊娠前3個月，胎兒對甲狀腺激素的需求主要依賴于通過胎盤轉(zhuǎn)運至胎兒的母體甲狀腺激素，因此，關(guān)注甲狀腺激素受體的表達同樣重要。

筆者發(fā)現(xiàn)，unexplained RSA患者較non-RAS人群THRβ1在胎盤絨毛表達顯著降低，這與Ziegelmuller等應(yīng)用免疫組化研究結(jié)果相一致[20]，而且發(fā)現(xiàn)：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤絨毛THRβ1表達下降在細胞滋養(yǎng)層細胞較合體滋養(yǎng)層細胞更顯著。

本例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)不排除TSHR、TPO、DUOX2及DUOXA2的多態(tài)性導(dǎo)致胎兒甲狀腺發(fā)育異常或甲狀腺激素合成障礙，從而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。此外，流產(chǎn)絨毛的 THRβ1在胎盤絨毛表達顯著降低，母體正常的甲狀腺激素與胎兒表達下降的甲狀腺激素受體結(jié)合，可導(dǎo)致甲狀腺激素功能不能正常發(fā)揮，最終導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育異常和流產(chǎn)。