關鍵詞：番木瓜；未成熟合子胚；胚性細胞懸浮系；體細胞胚發(fā)生；植株再生

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）02-0376-10

番木瓜（Carica papaya L.）是廣泛分布于全球熱帶亞熱帶區(qū)域的重要果樹，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]，被世界衛(wèi)生組織列為最有營養(yǎng)價值的十大水果之首[2]。隨著消費者對番木瓜認識的提高、消費者保健意識的增強以及番木瓜儲存運輸技術的發(fā)展進步，番木瓜逐漸受到廣大消費者的青睞，成為在中國農業(yè)品種結構調整和鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮重要作用的經濟作物[3-4]。然而，番木瓜環(huán)斑花葉病毒?。≒apaya ringspot virus，PRSV）嚴重限制了番木瓜產業(yè)的發(fā)展，其抗病品種的培育成為產業(yè)發(fā)展的關鍵[5]。可食用番木瓜抗病資源匱乏，栽培種遺傳基礎狹窄，通過傳統(tǒng)的雜交育種難以培育出抗病品種[5-6]；而分子育種技術則可有效地改良品種的抗病性，對PRSV 具有高抗性的華農1 號已成功培育并在我國釋放種植[7]。

建立高效植株再生技術體系是番木瓜分子育種技術研發(fā)的基礎。前人曾較多地報道直接利用番木瓜胚性愈傷組織誘導體細胞胚發(fā)生并獲得植株再生[8-13]，但該途徑存在基因型依賴、體細胞胚發(fā)育不同步、胚根端愈傷化導致生根質量差、體細胞胚發(fā)生率和植株再生率低等問題[14]，這些限制了轉基因技術的廣泛應用?；诖?，筆者在本研究中旨在建立一種基于胚性細胞懸浮培養(yǎng)的高效植株再生技術體系，提高體細胞胚發(fā)生和發(fā)育的同步性及其植株再生率，以期為番木瓜大量離體快繁、細胞工程育種和分子育種提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

以廣東省農業(yè)科學院果樹研究所番木瓜種質資源圃中紫暉品種為試驗材料，該品種具有豐產、優(yōu)質且適應性強等特性[15]。定植時采用組織培養(yǎng)兩性株種苗，采用常規(guī)管理辦法，植株生長正常。

1.2 外植體的選擇與處理

選擇生長勢旺盛的健康植株，掛牌標記兩性花開花日期。取開花坐果后110～120 d 的果實，參照魏岳榮等[4]的方法對果實進行表面消毒，縱向切開后收集種子，分離未成熟合子胚作為外植體。

1.3 愈傷組織誘導

將外植體接種于裝有30 mL愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MCI）的100 mL 錐形瓶中，在（27±1）℃下暗培養(yǎng)。MCI基本組成為：1/2 MS培養(yǎng)基+400 mg·L^-1谷氨酰胺+ 60 g·L^-1蔗糖+ 7 g·L^-1瓊脂粉，pH值5.8。為觀察2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D）質量濃度對愈傷組織誘導的影響，本試驗共設1、2、3、4 和5 mg·L^-1共5 個2，4-D質量濃度處理，以不添加2，4-D為對照。每個處理接種5 瓶，每瓶接種外植體7 個，3 次重復。培養(yǎng)60 d 后，統(tǒng)計愈傷組織和胚性愈傷組織誘導率。

1.4 胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

挑選松散易碎的淺黃色胚性愈傷組織團進行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基為MCI基本培養(yǎng)基，并根據(jù)1.3胚性愈傷組織誘導率統(tǒng)計結果添加適宜質量濃度的2，4-D，培養(yǎng)條件與1.3 相同。繼代時剔除褐化、致密組織和非胚性愈傷組織，繼代周期為28～30 d。

1.5 胚性愈傷組織的液體培養(yǎng)、篩選和均質胚性細胞懸浮系的建立

取優(yōu)質胚性愈傷組織約2 g，加入到裝有30 mL液體培養(yǎng)基（ML）的100 mL 錐形瓶中，在黑暗條件下，（27±1）℃、110 r ·min^-1振蕩培養(yǎng)。ML組成為胚性愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)基成分去除瓊脂粉，pH值5.8。初次懸浮培養(yǎng)7 d 后，參照魏岳榮等[16]的方法對培養(yǎng)物進行篩選和繼代培養(yǎng)，濾除大顆粒愈傷組織、細胞團和體細胞胚，直至獲得細胞分散且穩(wěn)定增殖的均質胚性細胞懸浮系（embryogenic cell system，ECS）。后期ECS 繼代過程中，每次取5 mL ECS 加入25 mL新鮮培養(yǎng)基中，繼代周期為21 d。

1.6 體細胞胚的誘導和成熟培養(yǎng)

取繼代培養(yǎng)后第10 天的ECS 5 mL，靜置后去除培養(yǎng)液，加入體細胞胚誘導培養(yǎng)基（MSI） 30 mL，MSI 組成為1/2 MS鹽+MS維生素+50 mg·L^-1肌醇+400 mg·L^-1 谷氨酰胺+30 g ·L^-1 蔗糖，pH 值5.8，110r ·min^-1振蕩培養(yǎng)21 d。將誘導的體細胞胚轉移至裝有20 mL體細胞胚成熟培養(yǎng)基（MSM）、表面鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm） 內，在（27±1）℃、黑暗條件下培養(yǎng)30～45 d，期間每15 d 更新一次培養(yǎng)基。MSM組成為MSI +5 g·L-1活性炭（activated carbon，AC）+4.0 g·L^-1凝膠，pH值5.8。

1.7 體細胞胚的萌發(fā)和生根培養(yǎng)

挑選發(fā)育正常的子葉期體細胞胚，在加有萌發(fā)培養(yǎng)基（MG）的培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm）中萌發(fā)培養(yǎng)。MG基本組成為MS+30 g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1瓊脂粉，pH值5.8。為觀察6-芐基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthlcetic acid，NAA）和AC組合對體細胞胚萌發(fā)和生根的影響，試驗共設MG1（0.4 mg · L^-1 6-BA+0.02 mg · L^{- 1} NAA）、MG2（0.1 mg · L^-1 6-BA+0.1 mg · L^-1 NAA+5 g · L^-1AC）、MG3（0.4 mg · L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1 NAA+5g·L^-1 AC）、MG4（0.4 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1 NAA+5 g ·L^-1 AC）、MG5（0.1 mg·L^-1 NAA+5 g ·L^-1 AC）和MSM共6 個處理，在（27±1）℃、12 h/12 h 光周期條件下培養(yǎng)，光照度54 μmol·m^-2 · s^-1。培養(yǎng)21 d 后統(tǒng)計體細胞胚萌發(fā)率、生根率、同步萌發(fā)和生根率及愈傷化比率。

1.8 植株再生和馴化培養(yǎng)

挑選正常萌發(fā)和生根的體細胞胚，轉移到植株再生培養(yǎng)基（MR）促進地上部和根系發(fā)育。MR組成為1/2 MS+0.1 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1吲哚丁酸（3-Indolebutyric acid，IBA）+10 g·L^-1活性炭+30 mg·L^-1蔗糖+7 g ·L^{- 1} 瓊脂粉，pH 值5.8，培養(yǎng)條件與1.7 相同。30 d 后統(tǒng)計植株再生率。輕輕拔出再生小植株，移栽到含有2/3 泥炭土+1/3 蛭石（體積分數(shù)）的基質營養(yǎng)杯中，在溫室大棚中進行馴化培養(yǎng)45～60 d，當植株生長發(fā)育至15 cm后即可移植到田間生長。

1.9 統(tǒng)計分析

各試驗處理均設置3 次重復，使用SPSS 15.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Duncan’s 多重比較法進行差異顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 外植體未成熟合子胚的分離獲取

本試驗以紫暉坐果后110～120 d 果實種子（圖1-A）的合子胚為外植體進行愈傷組織誘導。觀察發(fā)現(xiàn)，110～120 d 齡果實種子為未成熟種子，外層為白色肉質外種皮，內層中種皮仍為白色，尚未硬化。將種子置于超靜工作臺面的無菌濾紙中央，剝離外種皮后，以手術刀背面按壓種子中部，使內層種皮輕微破裂，然后輕輕按壓種子基部至中部，即可擠壓分離出完整的未成熟合子胚（圖1-B）。

2.2 愈傷組織誘導

接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基3 d 后，未成熟合子胚開始膨大。15 d 后，含有2，4-D的所有處理中未成熟合子胚開始愈傷組織分化，不含2，4-D的對照處理則未見愈傷組織形成。在愈傷組織誘導過程中，可觀察到淺褐色海綿狀愈傷組織（圖1-C a）、白色粉狀愈傷組織（圖1-C b）、淺黃色透明狀愈傷組織（圖1-D）和淺黃色松散易碎的胚性愈傷組織（圖1-E）。隨著培養(yǎng)時間的延長，部分胚性愈傷組織表面可觀察到叢狀體細胞胚（圖1-E a）的發(fā)生。

誘導培養(yǎng)60 d 后，統(tǒng)計愈傷組織和胚性愈傷組織誘導率。結果表明，1 mg·L^-1 2，4-D 處理愈傷組織誘導率為41.90%，2～5 mg·L^-1 2，4-D 處理均能誘導50%以上未成熟合子胚形成愈傷組織，其中4 mg·L^-12，4-D處理可獲得92.38%的最高愈傷組織誘導率。就胚性愈傷組織誘導率而言，4 mg·L^-1 2，4-D 處理效果最好，可達62.86%；其次為3 mg · L^-1 2，4-D 處理，兩者無顯著差異。當2，4-D 質量濃度增加至5 mg · L^{- 1} 時，胚性愈傷組織誘導率下降至38.10%（表1）。

2.3 胚性愈傷組織的增殖培養(yǎng)

為提高胚性愈傷組織質量，增加胚性愈傷組織數(shù)量，挑取胚性愈傷組織團，剔除褐化組織及非胚性愈傷組織，轉移至含4 mg·L^-1 2，4-D的MCI培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。3 個繼代周期后可獲得大量松散易碎的優(yōu)質胚性愈傷組織（圖1-F）。

2.4 胚性愈傷組織的液體培養(yǎng)、篩選和均質胚性細胞懸浮系的建立

優(yōu)質胚性愈傷組織被轉移至液體培養(yǎng)基后，在搖床的振蕩作用下，愈傷組織團較易散開，無褐化現(xiàn)象。繼代過程中，使用不同孔徑的篩網(wǎng)濾除體積較大的愈傷組織團塊、大細胞團和已形成的體細胞胚等培養(yǎng)物。5 個繼代周期后，可獲得由大量單細胞和小細胞團組成的均質的胚性細胞懸浮系（圖2-A～B）。

2.5 體細胞胚的誘導和成熟培養(yǎng)

均質胚性細胞在液體體細胞胚誘導培養(yǎng)基中經1 個繼代周期（21 d）的培養(yǎng)后，可形成大量球形胚（圖2-C）。將球形胚轉移到含有5 g·L^-1 AC的半固體體細胞胚成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)30～45 d（圖2-D），可逐步發(fā)育為成熟的子葉期體細胞胚（圖2-E），該過程中體細胞胚發(fā)生和發(fā)育的同步性較好。

2.6 體細胞胚的萌發(fā)和生根培養(yǎng)

挑選成熟的子葉期體細胞胚接種于含0.4 mg·L^-16-BA+0.02 mg·L^-1 NAA體細胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基MG1中培養(yǎng)（圖3-A），3 d 后可見體細胞胚開始萌發(fā)，7 d后可見到萌發(fā)的綠色子葉（圖3-B），同時體細胞胚根端開始出現(xiàn)愈傷化。培養(yǎng)21 d 后，萌發(fā)的體細胞胚已具備完整的下胚軸、子葉和芽（圖3-C），萌發(fā)率97.58%，但胚根端愈傷化嚴重，愈傷化比率為95.48%，有少量生根，同步生根率為18.18%（表2），根系數(shù)量少且質量差。該途徑萌發(fā)的芽可用于增殖，但均表現(xiàn)出基部愈傷化（圖3-D），生根難度大。

基于此，為改善番木瓜體細胞胚的萌發(fā)和生根質量，筆者在本試驗中比較了不同質量濃度6-BA和NAA組合及AC的作用效果（表2）。結果表明，與MG1 培養(yǎng)基比較而言，5 g·L^-1活性炭的添加，可有效促進成熟的子葉期體細胞胚萌發(fā)和生根同步進行，同時顯著降低愈傷化程度。MG2（圖3-E）、MG3（圖3-F）、MG4（圖3-G）和MG5（圖3-H）培養(yǎng)基中體細胞胚的同步萌發(fā)和生根率分別為80.47%、92.62%、84.05%和66.19%，愈傷化比率分別為55.95%、33.10%、74.76%和66.43%（表2），其中含0.4 mg·L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1 NAA+5 g·L^-1 AC的MG3 培養(yǎng)基促體細胞胚萌發(fā)和生根效果最佳。綜合以上結果分析，不同質量濃度的6-BA和NAA的添加會導致萌發(fā)體細胞胚根端及根系的愈傷化，而AC的添加可顯著降低愈傷化程度。

將成熟的子葉期體細胞胚接種于含5 g·L-1活性炭的不含任何激素的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖3-I），3 d 后即可見到體細胞胚下胚軸膨大伸長和基部生根，5 d 后根部出現(xiàn)大量根毛（圖3-J），14 d 后體細胞胚萌發(fā)率為97.86%（ 圖3- K），同步生根率為88.33%，其中已萌發(fā)但未能生根的體細胞胚基部表現(xiàn)為輕度愈傷化，愈傷化比率為11.67%（表2）。培養(yǎng)21 d 后，萌發(fā)生根的體細胞胚表現(xiàn)為下胚軸伸長、根系伸長且數(shù)量增加，未見愈傷化比率升高情況出現(xiàn)（圖3-L）。

2.7 植株再生和馴化

將萌發(fā)和生根的體細胞胚移植到含0.1 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1 IBA+10 g·L^-1AC的植株再生培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d 后，可獲得具有6～8 枚錐形小葉、根系發(fā)育良好的健康植株（圖4-A～B），植株再生率為81.36%。將上述植株輕輕拔出并清洗干凈根系附帶瓊脂，移植到透氣基質中，在前期加強保濕的情況下，經45～60 d 馴化培養(yǎng)，可獲得具8～10 枚真葉的種苗（圖4-C），并移植到田間進行性狀觀察。

3 討論

3.1 番木瓜未成熟合子胚的有效分離獲取及其胚性發(fā)生效果

番木瓜未成熟合子胚體積較小，長約3 mm，常規(guī)分離方法是在體視顯微鏡的輔助下進行剝離，操作難度較大，速度慢，效率低，且合子胚完整性差。筆者在本試驗中采用肉眼分離法，通過擠壓方式可有效分離獲取未成熟合子胚。該方法無需體視顯微鏡的輔助，簡單易操作，速度快，且分離的合子胚完整性好，可大大提高工作效率。

由體細胞啟動間接器官發(fā)生的過程包括胚性誘導和形態(tài)建成2 個階段，其中體細胞脫分化形成胚性愈傷組織的誘導階段非常關鍵，直接決定了后期形態(tài)建成和植株再生的成敗與效率，而胚性愈傷組織的誘導跟外植體材料密切相關。自1980 年Litz等[17]開展番木瓜體細胞胚性誘導研究以來，使用的外植體類型包括子葉[9，11，18- 19]、下胚軸[12- 13，19- 21]、葉片[18-19，22]、葉柄[22]、莖尖[11，18]、莖段[18，23]、幼根[18，23-24]、胚珠[25-26]、合子胚等[4，8-10，12，14，19，27-29]。綜合文獻結果及項目組前期研究數(shù)據(jù)（未公開發(fā)表）分析，以子葉、葉片、葉柄、莖和根為外植體時，愈傷組織誘導率可達50%～95%，但胚性愈傷組織誘導率低，體細胞胚發(fā)生能力較弱，且不同基因型材料之間差異顯著；而下胚軸、胚珠、合子胚則具有較高的胚性發(fā)生潛力，胚性愈傷組織誘導率可達到30%～77.5%，體細胞胚形成效果好，植株再生率高。被利用的合子胚可分為90～120 d 果實未成熟合子胚和成熟合子胚2 種，綜合比較而言，本試驗采用的110～120 d 的未成熟合子胚胚性誘導效果更佳，是番木瓜間接器官發(fā)生和高效植株再生的理想外植體材料。

3.2 不同質量濃度2，4-D對番木瓜未成熟合子胚胚性誘導的影響

體細胞脫分化受多種物理和化學因素的影響，其中生長素在體細胞向胚性狀態(tài)的轉變過程中起著重要作用，通過染色質修飾和激活特定轉錄因子來誘導相關基因表達[30-32]。就番木瓜胚性誘導而言，前人曾報道2，4-D是最佳化合物[8]，并在后續(xù)相關研究中被廣泛應用[9-13，27]。基于各種試驗材料的基因型、外植體類型、外源植物生長調節(jié)劑組合效果等差異，2，4-D處理質量濃度介于1～10 mg·L^-1之間，胚性愈傷組織誘導效果差異顯著。其中以10 mg·L^-1 2，4-D +250 mg·L-1 Carbenicillin 處理馬來西亞番木瓜品種Eksotika 90～100 d 齡果實合子胚，胚性愈傷組織誘導率最高可達到77.5%[27]。本試驗中，以自主選育番木瓜新品種紫暉為試驗材料，利用110～120 d 齡果實的未成熟合子胚為外植體，在不添加其他植物生長調節(jié)劑的情況下，1～5 mg·L^-1 2，4-D處理均能誘導形成胚性愈傷組織，其中4 mg·L^-1 2，4-D 處理效果最佳，能誘導62.33%的外植體獲得質量良好的淺黃色、松散易碎型胚性愈傷組織。鑒于胚性誘導階段2，4-D的添加可能會導致體細胞胚異常和無性系變異的發(fā)生[17，30]，在實際應用中，不同品種和試驗體系中2，4-D處理質量濃度與無性系變異發(fā)生之間的關系仍需驗證，應根據(jù)具體試驗目的進行綜合考慮和選擇。

3.3 番木瓜均質胚性細胞懸浮系建立的作用與重要性

誘導獲得的淺黃色、松散易碎型胚性愈傷組織可在固體培養(yǎng)基中得到有效增殖，生長速度適中。隨著繼代時間的延長，在胚性愈傷組織表面可形成叢生狀體細胞胚。在筆者及前人的研究中，通常直接利用胚性愈傷組織進行體細胞胚的誘導和成熟培養(yǎng)，從而獲得植株再生，但該途徑均表現(xiàn)出體細胞胚發(fā)育不同步、植株再生率低的特點[4，11-12]。ECS 具有增殖率高、培養(yǎng)物同步的優(yōu)勢[33]，本試驗經5 次繼代篩選培養(yǎng)后，可建立由生理狀態(tài)較一致的單細胞和小細胞團富集組成的均質ECS，體細胞胚誘導和成熟同步性好，可同時獲得大量發(fā)育成熟的子葉形體細胞胚，為后續(xù)體細胞胚的同步萌發(fā)和生根奠定了基礎。因此，均質ECS的建立成為番木瓜高效植株再生技術的關鍵。

3.4 番木瓜體細胞胚萌發(fā)和生根的同步化培養(yǎng)

目前番木瓜間接器官發(fā)生過程通常是先誘導成熟體細胞胚萌發(fā)，然后再誘導生根。在體細胞胚萌發(fā)過程中，往往添加6-BA、NAA等一些生長調節(jié)劑來促進萌發(fā)[8，25]。然而，目前的技術體系中最大的瓶頸在于萌發(fā)的體細胞胚胚根端極易出現(xiàn)愈傷化，并抑制有效根系的形成[10]。這是因為番木瓜組織培養(yǎng)過程中對生長素類物質極為敏感[34]，體細胞胚具有結合生長素的能力，這些生長素在隨后的分化過程中排入培養(yǎng)基，從而產生愈傷組織[35]。本試驗體系進一步驗證了該問題的存在，0.4 mg·L^-1 6-BA+0.02 mg·L^-1NAA組合在促進97.73%體細胞胚萌發(fā)的同時，導致95.45%的體細胞胚根端出現(xiàn)愈傷化，有效根系少，大大降低了植株再生率和存活率。補充添加5 g·L^-1AC則可有效促進93.33%體細胞胚萌發(fā)和生根同步進行，同時顯著降低愈傷化比率至33.37%。同時，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，成熟的子葉期體細胞胚在含有5 g·L^-1 AC、不添加任何植物生長調節(jié)劑的體細胞胚成熟培養(yǎng)基中可實現(xiàn)同步萌發(fā)和生根，同步萌發(fā)和生根率可達88.53%，且愈傷化程度輕，愈傷化比率僅11.47%。由此可見，就番木瓜發(fā)育成熟的子葉期體細胞胚的萌發(fā)和生根而言，6-BA和NAA并非必需因素。AC對番木瓜體細胞胚萌發(fā)和生根的積極效果與在櫟樹、衛(wèi)矛上的報道相似[36- 37]，這可能與AC具有吸附發(fā)育組織釋放的生長素類物質和次級代謝產物的作用密切相關[38-40]。

4 結論

以紫暉110～120 d 未成熟合子胚為外植體，最佳的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基為1/2 MS 培養(yǎng)基+4 mg · L^-1 2，4-D+400 mg·L^-1谷氨酰胺+ 60 g ·L^-1蔗糖。經5 次繼代篩選培養(yǎng)后，可建立由生理狀態(tài)較一致的單細胞和小細胞團富集組成的均質ECS。最優(yōu)體細胞胚發(fā)生方案為ECS 經液體培養(yǎng)方式誘導球形胚形成，在含1/2 MS鹽+MS維生素+50 mg·L^-1肌醇+400 mg·L^{- 1} 谷氨酰胺+30 g ·L^{- 1} 蔗糖+5 g ·L^{- 1}AC的培養(yǎng)基中促進體細胞胚的成熟及后續(xù)的同步萌發(fā)和生根，可有效緩解胚根端愈傷化現(xiàn)象。