關(guān)鍵詞：甜柿；果生刺盤(pán)孢；暹羅刺盤(pán)孢；哈銳炭疽菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S665.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0340-10

太秋甜柿是中晚熟甜柿品種，目前主要分布在中國(guó)南方地區(qū)，如浙江、江蘇、福建、湖北等地[1-4]。太秋甜柿具有獨(dú)特的風(fēng)味，營(yíng)養(yǎng)豐富，且保脆時(shí)間較長(zhǎng)，因此，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)，也是中國(guó)的主要出口水果之一，有著良好的國(guó)際市場(chǎng)價(jià)值[5]。

炭疽病是柿樹(shù)的主要病害，可侵染葉片、花和果實(shí)等部位，引起果實(shí)腐爛或枝條枯死等癥狀，也是柿貯藏期的主要病害之一[6]，而因其具有較高的含糖量和蛋白質(zhì)含量的特性，更易被炭疽菌侵染，造成果實(shí)的腐爛。目前，中國(guó)已報(bào)道的柿炭疽菌主要病原菌有哈銳炭疽菌（Colletotrichum horii）[7-8]、喀斯特炭疽菌（C. karstii）[9]、膠孢炭疽菌（C. gloeosporioi-des）[10]和果生刺盤(pán)孢（C. fructicola）[11]，國(guó)外報(bào)道的有尖孢炭疽菌（C. acutatum）[12]和暹羅炭疽菌（C. siamense）[13]、其中山東省甜柿炭疽病主要以哈銳炭疽菌為主，福建省以果生刺盤(pán)孢為主，各地區(qū)炭疽病病原菌種群類(lèi)型差異較大。近年來(lái)，浙江省金華市永康柿園內(nèi)太秋甜柿炭疽病逐年增加，主要因?yàn)樘鹗撂烤也〉牟≡N類(lèi)及規(guī)律不明確，甜柿病害發(fā)病癥狀相似，田間藥劑使用混亂，導(dǎo)致甜柿果實(shí)炭疽病發(fā)生加重，影響了甜柿產(chǎn)量及質(zhì)量。因此，弄清甜柿炭疽病炭疽菌的種類(lèi)、生物學(xué)特性及發(fā)生條件，不僅可以了解甜柿炭疽病的發(fā)生及影響因素，而且可以為甜柿炭疽病提供生態(tài)防治措施。筆者在本試驗(yàn)中主要對(duì)浙江永康太秋甜柿果實(shí)炭疽病種類(lèi)進(jìn)行確定，著重研究甜柿炭疽病不同病原小種間生物學(xué)特性和發(fā)生規(guī)律的差異，以期為甜柿炭疽病發(fā)病規(guī)律的解析及病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 甜柿炭疽病的發(fā)生及病原菌分離、鑒定

1.1.1 炭疽病調(diào)查、采集及分離 2021 年6—10 月，針對(duì)浙江省金華市永康市太秋甜柿果實(shí)炭疽病進(jìn)行病樣采集，采集時(shí)間為每月1 次，采摘太秋甜柿果實(shí)表面和萼片上發(fā)病癥狀較明顯的樣品，采集后的樣品保存于保鮮袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室后，采用組織分離法[11]進(jìn)行甜柿炭疽病病原菌分離，得到的分離物培養(yǎng)3 d 后在菌落邊緣挑取單菌絲至PDA平板內(nèi)進(jìn)行純化、備用。并觀察所有分離病菌的菌落特征，統(tǒng)計(jì)太秋甜柿果實(shí)表面和萼片的炭疽病菌分離率。將純化的菌種保存至浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所。

1.1.2 分離物致病性測(cè)定 選取代表菌株進(jìn)行致病性檢測(cè)，選取健康、大小和成熟度一致的太秋甜柿果實(shí)，在果實(shí)或萼片進(jìn)行接種，將純化的供試菌株接種至PDA平板中，26 ℃培養(yǎng)7 d 后，在菌落菌絲最外緣打取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅菌絲面朝寄主植物貼在果實(shí)表面或果蒂，再用含有無(wú)菌水的脫脂棉覆蓋在菌餅上，對(duì)其進(jìn)行保濕培養(yǎng)，放置于26 ℃ 16 h光照、8 h 黑暗的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行保濕培養(yǎng)，接種方式為針孔洞傷口接種和無(wú)傷口直接接種，待5 d 后觀察接種情況并記錄。

1.1.3 分離物分類(lèi)地位確定 將分離純化的代表菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，采用Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，利用ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS1 基因序列進(jìn)行擴(kuò)增[14-19]，引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)合NCBI-Blast 進(jìn)行序列比對(duì)。在NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)序列（表1），采用MEGA 7.0 和Bayesian對(duì)ITS、ACT、TUB2、GAPDH、CHS-1 聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和貝葉斯法建樹(shù)（Bayesian，Bpp），Bootstrap1000 次重復(fù)。

1.2 病菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將純化的甜柿炭疽病代表菌株轉(zhuǎn)至新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d 后，采用打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面一致朝下接種至供試培養(yǎng)基平板中央。供試培養(yǎng)基類(lèi)型為PDA（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基）、CA（胡蘿卜培養(yǎng)基）、CMA（玉米粉培養(yǎng)基）、RA（大米培養(yǎng)基）、OA（燕麥培養(yǎng)基）、GA（高粱培養(yǎng)基）、WA（水瓊脂培養(yǎng)基）。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。5 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[20]。

產(chǎn)孢量的測(cè)定：培養(yǎng)14 d 后，加入10 mL無(wú)菌水至供試平板，將培養(yǎng)基表面孢子完全洗脫后配制成孢子懸液，在光學(xué)顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的產(chǎn)孢總量。

1.2.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 采用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，菌絲面一致朝下接種至新的PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。5 d 后測(cè)量菌落直徑，14 d 后測(cè)量產(chǎn)孢總量，測(cè)量方法同1.2.1。

1.2.3 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 將菌餅（5 mm）接種至PDA 培養(yǎng)基，分別置于光照條件為全光（24 h 光照）、全暗（24 h 黑暗）、半光照（12 h 光+12 h 暗）下培養(yǎng)，每個(gè)處理3 次重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后測(cè)量菌落直徑，14 d 后測(cè)量產(chǎn)孢總量，測(cè)量方法同1.2.1。

1.2.4 pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1%HCl 溶液和NaOH溶液將培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)至4.01、5.03、6.09、7.03、8.02、9.03、10.09，每個(gè)處理3 次重復(fù)，在各培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的菌餅，密封處理后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行暗培養(yǎng)，5 d 后測(cè)量菌落直徑，14 d 后測(cè)量產(chǎn)孢總量，測(cè)量方法同1.2.1。

1.2.5 病菌致死溫度的測(cè)定 將在PDA上培養(yǎng)14 d的病原菌菌板加無(wú)菌水配置為105個(gè)·mL-1的孢子懸液，吸取50 μL 孢子懸液移入PCR 管中，放入梯度PCR 儀中，分別置于40.0、40.6、41.9、43.9、46.2、47.9、49.2、50.0、51.0、52.0 ℃，恒溫處理10 min 后吸取10 μL滴在PDA平板中央進(jìn)行涂板，放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d 后觀察菌落生長(zhǎng)情況，每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜柿炭疽病的發(fā)生及調(diào)查

2021 年6—10 月對(duì)浙江省金華市永康市太秋甜柿（共5 次樣品）果實(shí)上的病斑進(jìn)行了采樣及分離，如表2 所示，侵染太秋甜柿果實(shí)炭疽病病原類(lèi)型主要有Ⅲ類(lèi)，其中Ⅰ類(lèi)主要危害甜柿表面，形成黑色密密麻麻的微凸起小黑點(diǎn)，為初期發(fā)生病害，分離概率為21/66，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落灰綠色，分生孢子長(zhǎng)圓形或圓柱形，兩端圓，單孢，無(wú)色，大?。?9.626～31.933）μm ×（3.717～4.320）μm，代表菌株為T(mén)S32-G11-E（圖1-A～C）；Ⅱ類(lèi)主要危害柿蒂，常見(jiàn)為柿蒂先發(fā)病變褐后侵染至果實(shí)，后期果實(shí)全部腐爛，整個(gè)生育期均有發(fā)病，分離概率為54/100，病原菌在PDA 培養(yǎng)基上菌落灰綠色，分生孢子橢圓形，單孢，無(wú)色，大?。?.164～7.173）μm ×（14.202～15.568）μm，代表菌株為T(mén)3S1-E1-B（圖1-D～F）；Ⅲ類(lèi)主要為萼片，也可侵染果實(shí)，后期果實(shí)表面易產(chǎn)生橘色孢子堆，分離概率為16/45，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落灰綠色，孢子橢圓形，單孢，無(wú)色，大小（4.018～4.699）μm ×（11.547～12.768）μm，代表菌株為T(mén)2S12-G-A（圖1-G、H和I）。經(jīng)形態(tài)學(xué)描述初步將3類(lèi)病原菌鑒定為刺盤(pán)孢屬真菌（Colletotrichum sp.）。

2.2 分離菌株致病性測(cè)定

病原菌致病性測(cè)定結(jié)果表明，3 個(gè)甜柿炭疽病代表菌株均可侵染甜柿果實(shí)，代表菌株T2S32-G12-E 在有傷口和無(wú)傷口接種條件下均可致病，有傷口病原可侵入果肉，使組織變黑腐爛，直接接種病原可在柿果實(shí)表皮侵染形成小黑點(diǎn)，隨接種環(huán)境濕度升高而擴(kuò)大，與田間癥狀一致（圖1-J、L）。代表菌株T2S12-G-A 僅在有傷口的情況下侵染甜柿果實(shí)，果面變軟塌陷，7 d 后在接種寄主組織上可產(chǎn)生橘色孢子液，與田間癥狀相似（圖1-K）。代表菌株T3S1-E1-B一般由果蒂侵染甜柿果實(shí)及萼片，接種發(fā)現(xiàn)該病原菌侵染速度很快，7 d 即可使整個(gè)甜柿果實(shí)腐爛，果蒂及萼片發(fā)病癥狀與田間相似（圖1-M），因此該3 類(lèi)病原菌均為甜柿果實(shí)炭疽菌的致病菌。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

如圖2 所示，采用最大似然法和貝葉斯方法對(duì)代表菌株的5 個(gè)基因進(jìn)行序列擴(kuò)增和聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，代表菌株T2S32-G12-E 與C. horii聚在同一分支上，支持率達(dá)99%，貝葉斯概率達(dá)100%；代表菌株T3S1-E1-B與C. fructicola 聚在同一分支上，支持率達(dá)99%，貝葉斯概率達(dá)100%；代表菌株T2S12-G-A與C. siamense 聚在同一分支上，支持率達(dá)99%，貝葉斯概率達(dá)100%。因此，太秋甜柿果實(shí)上病原菌主要包含3 個(gè)不同的種，即哈銳炭疽菌（C. horii）、果生刺盤(pán)孢（C. fructicola）和暹羅刺盤(pán)孢（C. siamense），詳細(xì)分離結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 病菌生物學(xué)特性研究

2.4.1 不同培養(yǎng)基和光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 3種炭疽病菌在供試7 種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)（表3）。果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢菌絲生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為PDA、CMA和GA，果生刺盤(pán)孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基，暹羅刺盤(pán)孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基；哈銳炭疽菌菌絲生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為PDA和CA，產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為OA培養(yǎng)基。

2.4.2 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 在光照試驗(yàn)中，3 個(gè)甜柿炭疽病菌受光照條件的影響不同，哈銳炭疽菌和果生刺盤(pán)孢菌在全黑暗培養(yǎng)條件下菌絲生長(zhǎng)最快，而暹羅刺盤(pán)孢在全光照條件下菌絲生長(zhǎng)最快。哈銳炭疽菌在光暗交替的條件下可刺激產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達(dá)2.27×105個(gè)·mL-1，明顯高于全光照和全黑暗培養(yǎng)條件。全光照條件可以刺激果生刺盤(pán)孢菌產(chǎn)生孢子，14 d 可達(dá)6.53×106個(gè)·mL-1。而暹羅刺盤(pán)孢受光照條件的影響無(wú)明顯差異。

2.4.3 溫度和pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由圖3-A可知，3 種甜柿炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢適宜溫度均為30～35 ℃，最適生長(zhǎng)溫度30 ℃，果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢最適產(chǎn)孢溫度為35 ℃，哈銳炭疽菌最適產(chǎn)孢溫度為25 ℃；pH 值4～10 均適宜甜柿炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)（圖3-B），果生刺盤(pán)孢在pH 值5 和9 時(shí)產(chǎn)孢最佳，暹羅刺盤(pán)孢和哈銳炭疽菌在pH值9 和10時(shí)產(chǎn)孢最佳（表4）。

2.4.4 病菌致死溫度 將孢子懸液置40.0、40.6、41.9、43.9、46.2、47.9、49.2、50.0、51.0、52.0 ℃恒溫處理5、10、20 min后涂板。由表5可知，恒溫處理10 min，哈銳炭疽菌和暹羅刺盤(pán)孢的致死溫度為49.2 ℃，果生刺盤(pán)孢的致死溫度為47.9 ℃。

3 討論

3.1 甜柿炭疽病病原種類(lèi)及發(fā)生情況

炭疽病是柿果實(shí)的主要病害之一，引起柿果實(shí)腐爛或表面病斑，極大影響了甜柿果實(shí)的商品價(jià)值。刺盤(pán)孢屬真菌作為柿炭疽病的主要病原菌，其種類(lèi)較多且遺傳差異較大，因不同的氣候條件導(dǎo)致不同地區(qū)柿炭疽病的病原種類(lèi)不一致。目前中國(guó)山東省報(bào)道的引起甜柿炭疽病的病原主要以哈銳炭疽菌為主，福建省的果實(shí)炭疽病主要以果生刺盤(pán)孢為主[8，14]。結(jié)果表明，引起浙江省金華市永康市太秋甜柿炭疽病的主要有3 大類(lèi)，分別為哈銳炭疽菌、果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢，其中哈銳炭疽菌為前期炭疽病主要病原菌，一般在6—7 月發(fā)生，后期主要是果生刺盤(pán)孢引起的炭疽病，一般在8—10 月均有發(fā)生，在7—8 月份為該病原侵染高峰期。哈銳炭疽菌引起的炭疽病主要為早期果斑病，結(jié)合致病性測(cè)定結(jié)果分析，該病原在有傷口的時(shí)候可以快速引起甜柿的果腐病，但在無(wú)傷口的情況下也可直接在果面上形成小黑斑，在環(huán)境條件適宜時(shí)，擴(kuò)展成片果腐和果斑病，因此在甜柿果實(shí)初期應(yīng)主要對(duì)哈銳炭疽菌引起的果斑病進(jìn)行防治，以防病原菌擴(kuò)散形成初侵染來(lái)源。室內(nèi)致病性測(cè)定結(jié)果表明，果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢都不能直接侵染甜柿，必須在有傷口的情況下才能侵染甜柿，這與田間采集在萼片上分離的病原菌數(shù)量多于果面上有直接關(guān)系，因此，適當(dāng)給甜柿果實(shí)套袋，減少果面的損傷可以降低果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢引起的甜柿果實(shí)炭疽病。另外，果生刺盤(pán)孢菌在甜柿的萼片上分離率高于果面，因此，在萼片生長(zhǎng)期是果生炭疽菌防治的主要時(shí)期。

3.2 不同甜柿炭疽病病原菌生物學(xué)特性比較分析

炭疽菌是一類(lèi)重要的植物病原真菌，具有豐富的形態(tài)學(xué)及遺傳多樣性，筆者在本研究中針對(duì)3種甜柿炭疽菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，3 種甜柿炭疽病菌（C. horii、C. siamense 和C. fructicola）菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢適宜溫度均為30～35 ℃，最適生長(zhǎng)溫度30 ℃。哈銳炭疽菌最適產(chǎn)孢溫度為25 ℃，該結(jié)果說(shuō)明哈銳炭疽菌引起的炭疽病為偏低溫病害，適宜低溫可刺激該病原菌大量產(chǎn)孢，為后期侵染提供初侵染來(lái)源，這與浙江省6 月份柿果實(shí)初期即受到哈銳炭疽菌危害直接相關(guān)。產(chǎn)孢試驗(yàn)結(jié)果表明，果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢最適產(chǎn)孢溫度為35 ℃，這與果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢為甜柿生長(zhǎng)中后期主要病害有關(guān)，也與浙江省氣候氣溫相關(guān)[21]。果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢菌絲生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為PDA、CMA和GA，果生刺盤(pán)孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基，暹羅刺盤(pán)孢產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為CMA培養(yǎng)基；哈銳炭疽菌菌絲生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為PDA和CA，產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為OA培養(yǎng)基。說(shuō)明不同炭疽菌小種在菌絲生長(zhǎng)所需養(yǎng)分存在差異，且培養(yǎng)基的成分直接影響病原菌的產(chǎn)孢情況[22]。pH 值4～10 均適宜甜柿炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)，并且無(wú)顯著差異，說(shuō)明該病害的發(fā)生與環(huán)境pH無(wú)關(guān)。果生刺盤(pán)孢在pH值5 和9 時(shí)產(chǎn)孢最佳，暹羅刺盤(pán)孢和哈銳炭疽菌在pH 9 和10 時(shí)產(chǎn)孢最佳，說(shuō)明在較差環(huán)境下可以刺激各炭疽病菌產(chǎn)孢；各甜柿炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照均不敏感，但對(duì)其產(chǎn)孢的影響較大，持續(xù)光照有利于果生刺盤(pán)孢分生孢子的形成和產(chǎn)生，產(chǎn)孢量顯著高于暗培養(yǎng)條件，在光暗交替的條件下可刺激哈銳炭疽菌產(chǎn)孢，暹羅刺盤(pán)孢產(chǎn)孢對(duì)光照不敏感，這一研究結(jié)果表明適當(dāng)?shù)恼陉?yáng)處理可以減低該病害的傳播速度[23]。果生炭疽菌病菌分生孢子的致死溫度為51 ℃ 5 min，哈銳炭疽菌分生孢子的致死溫度為50 ℃ 5 min，暹羅刺盤(pán)孢菌分生孢子的致死溫度為52 ℃ 5 min。上述研究結(jié)果將為該病害的發(fā)生規(guī)律及病害防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)浙江金華永康太秋甜柿炭疽菌種類(lèi)的調(diào)查、致病性測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，明確了太秋甜柿的炭疽病病原主要有哈銳炭疽菌、果生刺盤(pán)孢和暹羅刺盤(pán)孢，其中暹羅刺盤(pán)孢引起太秋甜柿炭疽病為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。對(duì)病原菌生物學(xué)特性研究，首次比較了3 個(gè)不同太秋甜柿炭疽病病原小種的最適培養(yǎng)溫度、pH值、光照條件和孢子致死溫度，為太秋甜柿炭疽病科學(xué)防治提供了科學(xué)依據(jù)。