關(guān)鍵詞：歐李；ChNAC基因家族；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）02-0206-17

歐李（Cerasus humilis）屬于薔薇科櫻桃屬植物[1]，作為我國(guó)特有的矮生灌木果樹(shù)資源，是實(shí)施“退耕還林”的重要樹(shù)種之一。歐李樹(shù)種適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱、耐貧瘠、耐鹽堿，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，具有短期內(nèi)速生繁殖等優(yōu)點(diǎn)[2]。目前，歐李在我國(guó)中西部干旱和半干旱地區(qū)以及一些退化工礦用地推廣應(yīng)用，不僅作用于改良土壤結(jié)構(gòu)，還具有一定的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到非生物性脅迫和生物性脅迫的危害。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，為了更好的生存，植物產(chǎn)生了一系列生理生化機(jī)制來(lái)適應(yīng)、抵御不良環(huán)境的影響[4-5]?；虮磉_(dá)調(diào)控是一種重要的防御機(jī)制[6-7]。

NAC基因家族是植物中最大的基因家族之一，且是植物所特有的基因家族[8]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的命名取自矮牽牛（Petunia hybrida）的NAM（no apicalmeristem）基因、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ATAF1/ATAF2 基因、以及CUC2（cup-shaped cotyledon）基因的首字母[9]。1996 年，Souer 等[10]從矮牽牛中克隆出第一個(gè)NAC家族成員NAM。NAC基因家族參與植物的根、莖、葉、花等器官的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟、激素調(diào)控[11-14]。同時(shí)，NAC基因也參與植物激素調(diào)控，如擬南芥ATAF1、水稻OsNAP，水稻SNAC2[15- 17] 被證明參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；ANAC072 基因參與MeJA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，細(xì)胞分裂素、乙烯、赤霉素等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有NAC基因的參與[13， 18-19]。NAC基因在植物抗干旱、冷害、高溫、高鹽等非生物脅迫中同樣發(fā)揮著重要作用。Tran等[20] 過(guò)表達(dá)3 個(gè)NAC 基因（ANAC019、ANAC055、ANAC072），使擬南芥的抗旱能力顯著提高。Jeong等[21]發(fā)現(xiàn)干旱處理中OsNAC10 基因在水稻根和穗中的表達(dá)量顯著提高，當(dāng)該基因過(guò)表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)根生長(zhǎng)，顯著提高水稻產(chǎn)量。Lu等[22]將NAC家族中的ATAF1 基因敲除后，擬南芥ataf1-1 和ataf1-2 突變體在干旱響應(yīng)試驗(yàn)中的恢復(fù)率相比于野生型，提高了6 倍左右。Hao等[23]發(fā)現(xiàn)大豆中的GmNAC11 基因和GmNAC20 基因響應(yīng)冷害脅迫，基因過(guò)表達(dá)植株對(duì)低溫的耐受性顯著提高，Hegedus 等[24]在歐洲油菜中也證明NAC基因作用于冷害脅迫。Mao 等[25]將小麥中的TaNAC2 基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，其與對(duì)照組相比抗低溫能力顯著提高。Dong 等[26]發(fā)現(xiàn)玉米NAC家族中的NUT1 基因調(diào)控水分轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響玉米的高溫表型，而NUT1 基因表達(dá)的時(shí)空特異性有利于農(nóng)作物應(yīng)對(duì)田間水分的不斷變化，NUT1 基因可作為未來(lái)農(nóng)作物抗高溫脅迫的重要標(biāo)靶。梁曉慶[27]對(duì)番茄進(jìn)行高溫脅迫，結(jié)果表明抑制SINAC1 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株相比于正常植株抗高溫能力顯著降低，即證明SINAC1 基因正向調(diào)控番茄對(duì)高溫的抗性。Li 等[28]在擬南芥和大豆毛狀根中過(guò)表達(dá)GmNAC06 基因，植株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，表明GmNAC06 基因在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。Zheng等[29]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)OsNAC45 基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性。近年來(lái)，NAC基因家族在病害、蟲(chóng)害等生物性脅迫方面的研究也取得重要成果[30-36]。

基于已發(fā)表的歐李全基因組數(shù)據(jù)，筆者在本研究中采用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)歐李NAC基因家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)其家族成員的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、共線性、啟動(dòng)子進(jìn)行分析。同時(shí)，對(duì)不同脅迫處理下ChNAC基因成員的表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在挖掘脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵ChNAC基因，為歐李抗逆品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 歐李NAC基因家族成員的鑒定及理化性質(zhì)分析

歐李的全基因組數(shù)據(jù)來(lái)自Wang 等[37]的報(bào)道，從pafm（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得桃NAC基因的Hmmer文件，對(duì)歐李全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行本地BLAST。并結(jié)合NCBI 在線網(wǎng)站（ttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中桃、扁桃等相近物種的NAC序列對(duì)歐李的NAC基因進(jìn)行補(bǔ)充、完善并剔除重復(fù)。利用ExPASy 網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）分析歐李NAC基因的氨基酸數(shù)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)。利用PSORT在線網(wǎng)站（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SOPMA在線網(wǎng)站（https：//prabi.ibcp.fr/htm/site/web）對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[38-39]。

1.2 歐李NAC基因家族分類

從TAIR 在線網(wǎng)站中（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥NAC基因家族的蛋白質(zhì)序列與歐李NAC 基因家族的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA7 軟件，將Bootstrap 重復(fù)值設(shè)定為1000，其他參數(shù)均為默認(rèn)值，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[38-39]。

1.3 歐李NAC基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEME 在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme）對(duì)NAC 蛋白的motif 基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，整合NAC 蛋白的位置信息，利用Tbtools 軟件繪圖并分析[38-39]。

1.4 歐李NAC基因家族染色體定位和共線性分析

對(duì)歐李的NAC蛋白的位置信息和所處的染色體進(jìn)行編號(hào)整理。利用Tbtools軟件繪制圖表[38-39]。

1.5 歐李NAC基因家族啟動(dòng)子分析

從歐李全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找各NAC轉(zhuǎn)錄因子ATG 密碼子前2000 bp 的序列，利用PlantCARE在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webTbtools/plantcare/html/）對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)、整理。利用Origin軟件繪制功能分布柱狀圖[38-39]。

1.6 歐李NAC基因組織特異性分析

采歐李品種農(nóng)大4 號(hào)成熟期果實(shí)、葉片、根狀莖、種仁及一年生根送往Biomarker 公司，提取各樣品的總RNA，對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行Illumina HiSeq 平臺(tái)高通量測(cè)序。獲得不同組織基因的轉(zhuǎn)錄組文件后，利用注釋信息對(duì)NAC基因進(jìn)行篩選、整理。用Tbtool 軟件繪制基因表達(dá)熱圖[38-39]。

1.7 歐李NAC基因家族在脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析

以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)資源圃歐李品種農(nóng)大4 號(hào)嫩枝扦插苗做材料。待扦插苗長(zhǎng)至株高25 cm、具有10 枚葉片時(shí)，選擇根系發(fā)育旺盛的材料移至霍格蘭溶液中進(jìn)行水培。將植株分別置于加入了200 mmol·L-1 NaCl 溶液或20% PEG6000 溶液的霍格蘭溶液中，25 ℃處理48 h 作為鹽處理及干旱處理，將植株置于加入等量清水的霍格蘭溶液中，25 ℃處理48 h，作為對(duì)照。將植株置于霍格蘭溶液培養(yǎng)，分別進(jìn)行4 ℃處理48 h 做低溫處理或40 ℃處理48 h 做高溫處理，以25 ℃處理48 h，作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，48 h后分別在每株上采集植株中部3 枚葉片，液氮處理后送往Biomarker公司，取各樣品的總RNA，對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行Illumina HiSeq 平臺(tái)高通量測(cè)序。獲得不同組織基因的轉(zhuǎn)錄組文件后，利用注釋信息對(duì)NAC基因進(jìn)行篩選、整理。最后使用Tbtools軟件繪制歐李NAC基因表達(dá)熱圖[40-42]。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李NAC基因家族的理化性質(zhì)分析

通過(guò)本地BLAST 和NCBI 網(wǎng)站與桃等相近物種進(jìn)行比對(duì)，利用NCBI預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域，共篩選得到76 條NAC 基因，根據(jù)歐李的拉丁文種名（Cerasushumilis），按照基因位置信息依次編號(hào)為ChNAC01-ChNAC76（表1）。

歐李NAC 基因的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，歐李NAC 基因中氨基酸最少的為ChNAC23 基因，僅有85 個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為10 398.78 ku；最多的為ChNAC65 基因，有854 個(gè)氨基酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為95 216.85 ku。55 個(gè)ChNAC 基因的氨基酸數(shù)量集中在200～400 個(gè)之間。ChNAC 蛋白的等電點(diǎn)值在4.28～9.63 之間，其中堿性蛋白33 個(gè)，酸性蛋白17 個(gè)，中性蛋白26 個(gè)。ChNAC蛋白多為不穩(wěn)定蛋白，僅有15 個(gè)NAC蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白。其余61 個(gè)NAC 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40 為不穩(wěn)定蛋白。ChNAC蛋白的總平均疏水指數(shù)為-0.381～-1.023，均為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：ChNAC33 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；ChNAC55 蛋白定位于囊泡中；ChNAC02、ChNAC09、ChNAC11 等15 個(gè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中；其余ChNAC蛋白均定位于細(xì)胞核中。亞細(xì)胞定位結(jié)果的多樣性，表明ChNAC蛋白在細(xì)胞的不同部位，不同細(xì)胞器中行使不同的功能，為植物體的正常生命活動(dòng)提供保障。

為進(jìn)一步明確ChNAC蛋白的空間結(jié)構(gòu)，利用在線網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）分別對(duì)76條ChNAC蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，分析了其α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例。其中，α-螺旋所占比例在10.85%～45.05%之間；延伸鏈所占比例在9.69%～25.27%之間；β-轉(zhuǎn)角所占比例在0～9.65%之間；無(wú)規(guī)程卷曲所占比例在38.29%～70.60%之間（表2）。

2.2 歐李NAC基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

研究利用擬南芥的NAC基因序列做對(duì)照，參考Hisako 等[8]的研究結(jié)果將ChNAC 基因分為17 個(gè)亞族。不同的亞族在功能及進(jìn)化關(guān)系上存在差異[43]。ONAC01 亞族中不含有ChNAC 基因，說(shuō)明ONAC001 亞族中的擬南芥NAC 基因與ChNAC 基因無(wú)進(jìn)化關(guān)系，其余亞族中均存在數(shù)量不等的ChNAC基因。ChNAC成員數(shù)量超過(guò)10 個(gè)的有2 個(gè)亞族。ANAC001 亞族中的家族成員數(shù)量最多，有15 個(gè)家族成員。ONAC003 亞族中含有11 個(gè)家族成員。研究表明，ANAC001 亞族作用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答過(guò)程[44]，ONAC003 亞族參與調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)節(jié)[45]，推測(cè)歐李NAC基因多具備以上功能。其余亞族中的成員數(shù)量均小于10 個(gè)：TIP 亞族中有8 個(gè)家族成員；NAC2 亞族和OsNAC7 亞族中均有7 個(gè)家族成員；ONAC022 亞族中有6 個(gè)家族成員；NAP 亞族中有5 個(gè)家族成員；ANAC063 亞族中有3 個(gè)家族成員；ATAF亞族，NAM亞族，SENU5 亞族，TERN亞族，ANAC011 亞族及OsNAC8 亞族中都有2 個(gè)家族成員。AtNAC3 亞族，NAC1 亞族中僅具有1 個(gè)家族成員（圖1）。

2.3 歐李NAC基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

ChNAC基因CDS片段數(shù)量在1～8 個(gè)之間，多數(shù)CDS 片段數(shù)量為3～6 個(gè)，ChNAC15、ChNAC23 基因均為一整段的CDS 序列，其中沒(méi)有內(nèi)含子插入。ChNAC65 基因由8 個(gè)CDS片段組成，CDS片段數(shù)量最多（圖2）。

使用MEME在線網(wǎng)站將Motif 值設(shè)置為20，對(duì)歐李的NAC 基因進(jìn)行顯示分析。結(jié)果表明，ChNAC 基因的Motif 數(shù)量并不完全一致。Motif1、Motif2、Motif7 出現(xiàn)的次數(shù)最多，且Motif2 總出現(xiàn)在序列的最前端，有35 個(gè)ChNAC 基因均由Motif2、Motif8、Motif4、Motif5、Motif3、Motif6、Motif1、Motif7組成，有11 個(gè)ChNAC 基因是在上述Motif 后端插入了其他一個(gè)或幾個(gè)Motif 組成，有10 個(gè)ChNAC基因是在上述基礎(chǔ)上少了一個(gè)或幾個(gè)Motif 組成，ChNAC08 基因和ChNAC23 基因都僅含有2 個(gè)Motif，Motif13 只在ChNAC26 基因中出現(xiàn)了1 次，ChNAC43 基因中的Motif11、Motif18 連續(xù)出現(xiàn)了2次（圖2）。

2.4 歐李NAC基因家族染色體分布及種內(nèi)共線性分析

利用ChNAC 基因的注釋信息和Tbtools 繪圖軟件，可以清楚直觀地了解ChNAC 基因在歐李8條染色體上的分布情況。如圖3 所示，ChNAC基因在染色體上的分布是不均勻的。第五條染色體上（Chr5）ChNAC基因的數(shù)量最多，有19 個(gè)家族成員，且多集中于染色體的前端。其次是第一條染色體（Chr1） 上，有12 個(gè)ChNAC 家族成員且分布較均勻。第三條染色體（Chr3）和第七條染色體（Chr7）上家族成員的數(shù)量是一致的，都有9 個(gè)家族成員。第四條染色體（Chr4）上家族成員數(shù)量最少，僅有4個(gè)家族成員。

為了進(jìn)一步明確ChNAC基因在染色體上的分布情況，對(duì)ChNAC基因的種內(nèi)共線性進(jìn)行了注釋和分析，結(jié)果表明（圖4），ChNAC基因家族中存在8 對(duì)共線性基因：ChNAC12- ChNAC08、ChNAC11-ChNAC49、ChNAC73-ChNAC75、ChNAC20-ChNAC01、ChNAC20-ChNAC64、ChNAC01-ChNAC64、ChNAC25-ChNAC65、ChNAC27- ChNAC66，其中ChNAC01、ChNAC20、ChNAC64 這3 條基因是互為共線性，推測(cè)以上8 對(duì)基因可能是由染色體大片段復(fù)制而成的。

2.5 歐李NAC基因啟動(dòng)子分析

為便于預(yù)測(cè)ChNAC基因可能所具有的潛在功能，對(duì)ChNAC基因起始密碼子前2000 bp 的序列進(jìn)行分析，并利用繪圖軟件進(jìn)行整理并繪圖。結(jié)果如圖5 所示。ChNAC 基因順式作用元件中除了CAAT、TATA等保證基因家族進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄活動(dòng)所需的組成型轉(zhuǎn)錄元件外，還含有植物激素類響應(yīng)元件：TGA-element（生長(zhǎng)素響應(yīng)元件）、TCA-element（水楊酸響應(yīng)元件）、P-box（赤霉素響應(yīng)元件）、ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、TGACG-motif（茉莉酸甲酯響應(yīng)元件）；植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件：MSA-like（細(xì)胞周期響應(yīng)元件）、circadian（晝夜節(jié)律控制響應(yīng)元件）、RY-element （種子特異性響應(yīng)元件）、O2-site（玉米醇溶蛋白代謝元件）、CAT-box（分生組織的表達(dá)元件）、GCN4-motif （胚乳發(fā)育元件）、HD-Zip 1（參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元素元件）；結(jié)合位點(diǎn)MBS（MYB結(jié)合位點(diǎn)元件）、HD-Zip 3（蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)元件）、Box 4（光響應(yīng)元件）、LTR（低溫脅迫響應(yīng)元件）、ARE（厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件）、TC-rich repeats（參與防御和應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件）等。其中，占比較大的是組成型轉(zhuǎn)錄元件、植物激素類響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件。

2.6 歐李NAC基因組織特異性分析

歐李農(nóng)大4 號(hào)不同組織中，ChNAC基因的表達(dá)量存在差異（圖6）。ChNAC01、ChNAC07、ChNAC08等16 個(gè)基因在果實(shí)中的表達(dá)量最高，且ChNAC07基因僅在果實(shí)中表達(dá)；ChNAC50、ChNAC53、ChNAC63 等15 個(gè)基因在葉片中的表達(dá)量最高，且ChNAC13、ChNAC53、ChNAC63 基因僅在葉片中表達(dá)；ChNAC17、ChNAC66、ChNAC62 等15 個(gè)基因在根狀莖中表達(dá)量最高，且ChNAC17、ChNAC59、ChNAC68 基因僅在根狀莖中表達(dá)；ChNAC15、ChNAC46 等16 個(gè)基因在真根中的表達(dá)量最高；ChNAC36、ChNAC37 等10個(gè)基因在種仁中的表達(dá)量最高。ChNAC23、ChNAC45、ChNAC47、ChNAC54 這4 個(gè)基因在上述組織中均不表達(dá)，推測(cè)其可能在花或其他器官中表達(dá)。ChNAC基因表達(dá)量在不同組織中存在差異，表明不同的ChNAC基因調(diào)控不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育，即ChNAC基因的功能存在多樣性，具有不同的生物學(xué)作用，ChNAC基因在歐李的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著巨大作用。

2.7 歐李NAC基因在非生物脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析

對(duì)60 個(gè)ChNAC 基因在脅迫中的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明（ 圖7）：在鹽脅迫中，ChNAC15、ChNAC65、ChNAC74 等40 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC24、ChNAC26、ChNAC27 等14 個(gè)基因的表達(dá)量下降，ChNAC36、ChNAC37、ChNAC39 等6 個(gè)基因的表達(dá)量處理前后均差距不大；在模擬干旱脅迫中ChNAC01、ChNAC03、ChNAC18 等38 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC24、ChNAC11、ChNAC13 等13 個(gè)基因的表達(dá)量下降，ChNAC09、ChNAC10、ChNAC34 等9 個(gè)基因的表達(dá)量處理前后差距不大；在高溫脅迫中，ChNAC08、ChNAC09、ChNAC10 等38 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC01、ChNAC13、ChNAC25 等19 個(gè)基因的表達(dá)量下降。ChNAC41、ChNAC62、ChNAC63 這3 個(gè)基因的表達(dá)量處理前后差距不大；在低溫脅迫中，ChNAC24、ChNAC25、ChNAC35 等40 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)，ChNAC01、ChNAC03、ChNAC13 等18 個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)，ChNAC15、ChNAC63 這2 個(gè)基因的表達(dá)量在處理前后差距不大。綜上，大多數(shù)NAC基因在脅迫條件下，通過(guò)正向調(diào)控來(lái)激活抗逆機(jī)制的運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

在脅迫處理下，一些基因的表達(dá)模式基本相似，如：ChNAC24 基因和ChNAC25 基因在低溫脅迫下均為上調(diào)表達(dá)；在鹽脅迫、模擬干旱及高溫脅迫下均下調(diào)表達(dá)。ChNAC31 基因、ChNAC32 基因和ChNAC33基因在上述4 種脅迫下表達(dá)量均上調(diào)。

ChNAC49 基因在上述脅迫下表達(dá)量均顯著升高。在鹽脅迫下，ChNAC49 基因表達(dá)量與對(duì)照組相比上調(diào)了477 倍；在模擬干旱脅迫下，ChNAC49 基因表達(dá)量與對(duì)照組相比上調(diào)了124 倍；在低溫脅迫下，ChNAC49 基因與對(duì)照組相比表達(dá)量上調(diào)了28倍。ChNAC08 基因在高溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)值最大，與對(duì)照組相比上調(diào)了70.6 倍。ChNAC49 基因在高溫脅迫下表達(dá)量的上調(diào)值僅次于ChNAC08 基因，與對(duì)照組相比其上調(diào)了27.95 倍。ChNAC64 基因在鹽脅迫下的表達(dá)量下降幅度最多，僅為對(duì)照組的14.29%；ChNAC17 基因在模擬干旱脅迫下表達(dá)量的下降幅度最多，僅為對(duì)照組的15.96%；ChNAC01 基因的表達(dá)量在高溫脅迫下的下降幅度最多，表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的16.01%；ChNAC11 基因的表達(dá)量在高溫脅迫下的下降幅度最多，表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的26.14%。說(shuō)明這幾個(gè)基因在上述4 種脅迫下發(fā)揮著更重要的作用，是保證脅迫環(huán)境中植株正常生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵，對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行脅迫誘導(dǎo)處理，可能會(huì)獲得所需的抗性植株。

3 討論

通過(guò)生物信息學(xué)分析首次從歐李基因組中篩選出76 個(gè)NAC基因家族成員。ChNAC基因家族成員數(shù)量低于水稻（151）[8]、核桃（121）[41]、甘蔗（85）[46]、龍眼（114）[47]、西瓜（104）[48]等，高于黑麥草（72）[49]等，綜合來(lái)看，ChNAC 家族成員數(shù)量相比于其他物種較少，可能是基因組中沒(méi)有大規(guī)模的片段復(fù)制且相對(duì)保守造成的[50]。

Ooka 等[8]首次根據(jù)NAC 基因的結(jié)構(gòu)與功能將水稻和擬南芥的NAC基因家族分為17 個(gè)亞族，大多數(shù)學(xué)者多用此方法作為NAC基因家族的分類標(biāo)準(zhǔn)。筆者在本研究中以擬南芥NAC基因作為參照將ChNAC 基因家族分為17 個(gè)亞族，各亞族所包含的ChNAC家族成員數(shù)量不同，其功能也可能存在差異。Clercq 等[51]證明擬南芥NAC2 亞族基因參與植物氧化的應(yīng)激反應(yīng)。Fujiwara 等[45]認(rèn)為ONAC003亞族基因參與開(kāi)花調(diào)節(jié)。依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的同源關(guān)系，可以推測(cè)ChNAC對(duì)應(yīng)亞族中的基因可能具有相似功能。NAM亞族及NAC1 亞族中的擬南芥基因，被證明與擬南芥的形態(tài)發(fā)生有關(guān)[52]，由此推測(cè)ChNAC52 基因、ChNAC62 基因、ChNAC68 基因中的一種或者幾種，可能作用于歐李的形態(tài)發(fā)生過(guò)程中。ATAF、AtNAC3 亞族參與擬南芥的應(yīng)激反應(yīng)[53]，與其同源性高的ChNAC基因，可能在歐李的抗旱、抗鹽堿方面發(fā)揮著重要的作用。

啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，多數(shù)位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，關(guān)系到基因的時(shí)空表達(dá)，是基因的開(kāi)關(guān)，影響基因的表達(dá)程度。對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，可以推測(cè)其潛在功能[54- 58]。ChNAC68、ChNAC72、ChNAC76 等基因存在種子特異性作用元件，推測(cè)其可能在歐李種子胚乳的發(fā)育中具有重要作用；ChNAC03、ChNAC05 等基因存在胚乳表達(dá)元件，提示這些基因可能作用于種子表達(dá)或者種子萌發(fā)時(shí)期；ChNAC04、ChNAC05、ChNAC06 等基因含有分生組織表達(dá)的相關(guān)作用元件，其可能作用于植物分生組織的形成；ChNAC03、ChNAC72 等基因的作用元件表明其可能誘導(dǎo)參與柵欄葉肉細(xì)胞分化的元素形成；O2-site 是一種代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控有關(guān)的作用元件，ChNAC03、ChNAC04、ChNAC05 等基因存在這種啟動(dòng)子元件說(shuō)明這些基因可能參與玉米醇溶蛋白代謝途徑；ChNAC基因的啟動(dòng)子中含有許多響應(yīng)激素調(diào)控的作用元件（TGA-elemet 響應(yīng)生長(zhǎng)素調(diào)控，P-box響應(yīng)赤霉素調(diào)控，TCA-elemet 響應(yīng)水楊酸調(diào)控，ABRE 響應(yīng)脫落酸調(diào)控，TGACG-motif 響應(yīng)茉莉酸甲酯調(diào)控）防御基因和應(yīng)激反應(yīng)作用元件提示基因在應(yīng)對(duì)脅迫方面有重大作用，如ChNAC03、ChNAC04、ChNAC05 等基因。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明ChNAC基因家族作用于歐李的生長(zhǎng)、發(fā)育、組織分化、抗逆等多個(gè)方面，這與其他物種中NAC基因家族的研究結(jié)果相一致[59-61]。

當(dāng)植物感受到外界刺激時(shí)，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞給脅迫應(yīng)答因子，從而激活植物的抗逆反應(yīng)，減少植物受到的損傷，NAC基因在這個(gè)過(guò)程中扮演著重要角色。鹽脅迫被認(rèn)為是一種滲透脅迫[62]，有學(xué)者認(rèn)為，NAC基因在鹽脅迫時(shí)作用于植物ABA、乙烯、GA等代謝途徑，促進(jìn)這些激素的合成，從而提高植物的抗鹽性[63-64]；也有學(xué)者認(rèn)為，鹽脅迫時(shí)可通過(guò)NA+、K+離子的改變，或可溶性糖、游離脯氨酸等低分子滲透調(diào)節(jié)物的增加來(lái)維持體內(nèi)的滲透壓，進(jìn)而抵御鹽脅迫，維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育[65-66]。后續(xù)可對(duì)鹽脅迫下歐李NAC轉(zhuǎn)基因植株中上述物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而來(lái)驗(yàn)證這一猜想。溫度脅迫時(shí)，NAC基因主要通過(guò)調(diào)節(jié)溫度應(yīng)激基因啟動(dòng)子的表達(dá)及合成，進(jìn)而來(lái)激發(fā)植物的抗逆機(jī)制的運(yùn)作[67-68]。干旱脅迫時(shí)，一類NAC轉(zhuǎn)錄因子與MYC-like 元件結(jié)合，在脅迫應(yīng)答中起作用[20]，另一類NAC基因[69]主要在氣孔的保衛(wèi)組織中表達(dá)，當(dāng)植物感受到外界刺激時(shí)，會(huì)促進(jìn)氣孔關(guān)閉，從而使植株的抗旱性提高。Wang 等[70]在擬南芥中對(duì)ChNAC06 基因過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫下表達(dá)量升高，根系中ABA敏感性升高，抗干旱能力顯著提高。筆者在干旱脅迫下所獲得的結(jié)果與之相一致。尤其是ChNAC49 基因，在鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)幅度均最大，在高溫脅迫下的表達(dá)量上調(diào)幅度僅次于ChNAC08 基因。推測(cè)其可能在更多的脅迫下同樣發(fā)揮著重要的作用，對(duì)歐李的抗性研究可能是一種“關(guān)鍵基因”。且該基因在葉片、根狀莖、根中均表達(dá)?？蓪?duì)該基因進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)處理，獲得轉(zhuǎn)基因植物，以期挖掘出ChNAC 基因家族更多的潛在功能，為歐李抗性植株的培育做貢獻(xiàn)，也可根據(jù)不同品種ChNAC基因家族的表達(dá)量，初步篩選出具有特殊抗性的歐李品種。

4 結(jié)論

筆者在本研究中首次鑒定并分析了76 個(gè)歐李NAC 基因家族成員，明確了脅迫條件下各ChNAC基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)ChNAC49 基因在各脅迫處理下表達(dá)量的變化幅度顯著高于其他基因，后期可對(duì)ChNAC49 基因進(jìn)行克隆，培育出抗性更強(qiáng)的歐李轉(zhuǎn)基因株系，為ChNAC基因家族的功能驗(yàn)證奠定了理論基礎(chǔ)。