李長寶，宋保新，沈俊巖，張?jiān)迄i

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH)是指因動(dòng)脈瘤造成的腦部血管破裂，使血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔而引起的臨床綜合征，其病死率高達(dá)40%～50%[1-2]。因此尋找能準(zhǔn)確評(píng)估患者預(yù)后效果的敏感生物標(biāo)志物，對(duì)合理制定治療方案及改善預(yù)后意義重大。小窩蛋白(caveolave)是細(xì)胞質(zhì)膜上直徑為50～100 nm的瓶型內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，小窩蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是caveolave家族中主要功能蛋白，主要發(fā)揮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝等重要過程[3]。有研究表明，Cav-1在惡性腫瘤和炎性疾病中異常表達(dá)[4-5]。叉頭框蛋白O3a(forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a)是FOX基因亞家族的重要組成之一，其在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、自噬等生理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[6]。有研究證實(shí)，抑制FoxO3a磷酸化在一定程度上可改善帕金森模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[7]。目前Cav-1、FoxO3a主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，臨床中探究二者與aSAH患者的研究鮮少，因此，本研究探討aSAH患者血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系，旨在為aSAH的診治提供新思路，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年11月—2021年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院平谷醫(yī)院收治的aSAH患者128例為aSAH組，男74例，女54例，年齡28～75(56.39±6.58)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為19.04～28.61(24.13±3.42)kg/m2。另選取同期醫(yī)院健康體檢者95例為健康對(duì)照組，男54例，女41例，年齡26～75(55.47±6.46)歲；BMI為18.81～28.52(24.02±3.37)kg/m2。2組受試者性別、年齡、BMI等臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLSP2018第97號(hào))，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：① aSAH患者均符合“中國蛛網(wǎng)膜下腔出血診治指南2019”中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②aSAH首次發(fā)病住院；③從發(fā)病至住院時(shí)間不超過48 h；④發(fā)病前腦部無外傷。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院24 h內(nèi)死亡；②患有傳染性疾病者；③合并心、肝、腎重要器官疾病及惡性腫瘤者；④臨床資料不完整及不積極配合治療者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清Cav-1水平檢測：采集aSAH患者入院24 h內(nèi)、體檢健康者體檢當(dāng)日空腹靜脈血6 ml，離心留取上清液于EP管中，保存于-80℃?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清Cav-1水平，嚴(yán)格按照人Cav-1 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 血清FoxO3a mRNA表達(dá)水平檢測：上述血清樣品中加入Trizol試劑(武漢菲恩生物科技有限公司)進(jìn)行總RNA提取，采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步行qRT-PCR試驗(yàn)，嚴(yán)格按照2xSYBR Green PCR Master Mix試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行操作，F(xiàn)oxO3a mRNA的內(nèi)參為GAPDH。FoxO3a mRNA引物序列：上游引物5′-AAGCCAGCTACCTTCTCTTCCA-3′，下游引物5′-GTGGCTAAGTGAGTCCGAAGTGA-3′；GAPDH：上游引物5′-ATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，引物由武漢菲恩生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s、95℃ 5 s、60℃ 35 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。FoxO3a mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△CT法計(jì)算。

1.3.3 術(shù)后隨訪：對(duì)aSAH患者出院后行電話、微信或門診的方式進(jìn)行隨訪6個(gè)月，隨訪截止日期2022年6月30日。采用格拉斯哥預(yù)后評(píng)分(GOS)評(píng)估患者預(yù)后情況[9]，其標(biāo)準(zhǔn)為：患者死亡為1分，植物人狀態(tài)為2分，重度殘疾但有清楚的意識(shí)為3分，略微殘疾但可以正常生活為4分，恢復(fù)正常生活為5分。GOS評(píng)分≤3分納入預(yù)后不良亞組(n=41)，GOS評(píng)分>3分則納入預(yù)后良好亞組(n=87)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，aSAH組患者血清Cav-1表達(dá)水平顯著降低，F(xiàn)oxO3a mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見表1。

表1 健康對(duì)照組與aSAH組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達(dá)水平比較

2.2 不同預(yù)后亞組血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達(dá)水平比較 預(yù)后不良亞組患者血清Cav-1水平低于預(yù)后良好亞組，F(xiàn)oxO3a mRNA表達(dá)水平高于預(yù)后良好亞組(P<0.01)，見表2。

表2 不同預(yù)后aSAH患者血清Cav-1、FoxO3a mRNA表達(dá)水平比較

2.3 不同預(yù)后aSAH患者的臨床資料比較 預(yù)后不良亞組患者高血壓史、糖尿病史、改良Fisher分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、Hung-Hess分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、WFNS分級(jí)Ⅳ～Ⅴ級(jí)、動(dòng)脈瘤直徑>10 mm比例均高于預(yù)后良好亞組(P<0.05)，2組其余資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組aSAH患者的臨床資料比較

2.4 多因素Logistic回歸分析影響aSAH患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素 以上述結(jié)果中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的量(高血壓史、糖尿病史、改良Fisher分級(jí)、Hung-Hess分級(jí)、WFNS分級(jí)、動(dòng)脈瘤直徑、Cav-1、FoxO3a mRNA)為自變量，以aSAH患者是否發(fā)生預(yù)后不良為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，改良Fisher分級(jí)高、Hung-Hess分級(jí)高、血清FoxO3a mRNA水平高是aSAH患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，血清Cav-1水平高是其保護(hù)因素(P<0.01)，見表4。

表4 多因素Logistic回歸分析影響aSAH患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

2.5 血清Cav-1、FoxO3a mRNA評(píng)估aSAH患者預(yù)后的價(jià)值 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，血清Cav-1、FoxO3a mRNA及二者聯(lián)合評(píng)估aSAH患者預(yù)后的AUC分別為0.855、0.832、0.902，二者聯(lián)合評(píng)估aSAH患者預(yù)后的效能高于單項(xiàng)預(yù)測(Z/P=2.121/0.034、2.623/0.009)，見表5、圖1。

圖1 血清Cav-1、FoxO3a mRNA對(duì)aSAH患者預(yù)后評(píng)估的ROC曲線

表5 血清Cav-1、FoxO3a mRNA對(duì)aSAH患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值

3 討 論

aSAH是嚴(yán)重危及生命安全的腦卒中類型，其發(fā)病率占腦血管疾病的12%～20%，具有極高的致死率，高達(dá)10%～25%的患者在入院前死亡[10]。血管介入和開顱夾閉是臨床上目前使用最多的手術(shù)方式，雖然醫(yī)療技術(shù)有所提高，但患者的預(yù)后情況仍不容樂觀[11-12]。目前，改良Fisher分級(jí)、Hung-Hess分級(jí)是aSAH患者預(yù)后的主要評(píng)估指標(biāo)，但該方法存在一定的主觀弊端。因此，尋找敏銳有效的aSAH預(yù)后評(píng)估指標(biāo)是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。目前，aSAH的復(fù)雜機(jī)制尚未明晰，但有研究認(rèn)為血腦屏障通透性增加、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自噬是促進(jìn)aSAH發(fā)生發(fā)展和預(yù)后不良的重要原因[13-15]。

caveolave家族有Cav-1、Cav-2、Cav-3 3種蛋白亞型，Cav-1是其中主要的蛋白成分，其基因位于第7號(hào)染色體的D7S522基因座上，在腦組織內(nèi)主要于神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元上表達(dá)，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血腦屏障完整性、自由基形成等功能，促進(jìn)神經(jīng)元突觸再生及髓鞘修復(fù)等功能[16]。Cav-1水平低的急性缺血性腦卒中患者較Cav-1水平高的患者發(fā)生腦微出血的風(fēng)險(xiǎn)升高了3倍[17]。已有研究證實(shí)，Cav-1在急性腦梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病中扮演重要角色[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，aSAH患者血清Cav-1表達(dá)水平較健康人降低，說明Cav-1參與aSAH病理過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在大鼠模型前腦室內(nèi)注射微小RNA-103-3p(miR-103-3p)抑制劑可增加Cav-1水平，血腦屏障通透性隨之降低且神經(jīng)功能也有所改善[20]。張高嬌等[21]通過研究小鼠腦缺血再灌注損傷模型發(fā)現(xiàn)，Cav-1 siRNA使小鼠腦組織中Cav-1蛋白表達(dá)下降，可以明顯逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rb1的腦保護(hù)作用，說明Cav-1蛋白介導(dǎo)了人參皂苷Rb1對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠的腦保護(hù)作用。本結(jié)果顯示，aSAH預(yù)后不良患者血清Cav-1表達(dá)水平低于預(yù)后良好患者，Cav-1水平高是aSAH患者預(yù)后的保護(hù)因素，說明Cav-1可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白、抑制活性氮類釋放及基質(zhì)金屬蛋白酶活性，使密封蛋白-5重新分布，減少有害物質(zhì)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，上調(diào)Cav-1水平，有助于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接完整性，減少血管內(nèi)皮通透性，從而使血腦屏障破壞減輕，aSAH患者預(yù)后情況也相應(yīng)較好[22]。

FoxO3a是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的FoxO蛋白成員，廣泛分布于人體，其可被磷酸化、乙?；头核鼗谡{(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞自噬中也起著重要作用[23]。過度自噬和細(xì)胞凋亡可能是腦出血疾病的發(fā)展機(jī)制。FoxO3a對(duì)自噬基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬相關(guān)蛋白12(Atg12)等存在調(diào)控作用，其在自噬激活中有重要作用。以往研究證實(shí)，F(xiàn)oxO3a高表達(dá)與腦出血發(fā)病有關(guān)，在腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭蠪oxO3a表達(dá)明顯上升，通過靶向抑制FoxO3a能夠?qū)δX出血的神經(jīng)功能起保護(hù)作用[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，aSAH患者血清FoxO3a mRNA表達(dá)水平較健康人升高，且預(yù)后不良患者血清FoxO3a mRNA表達(dá)水平較預(yù)后良好患者升高，提示FoxO3a mRNA在aSAH的發(fā)生和患者術(shù)后恢復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。FoxO3a mRNA在aSAH疾病中的可能機(jī)制為激活細(xì)胞自噬和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而加劇神經(jīng)損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)/沉默信息調(diào)節(jié)因子6(SIRT6)/FoxO3a途徑的激活可改善SAH大鼠的神經(jīng)功能[26]。陸飛宇等[27]研究顯示，通過在腦出血模型大鼠側(cè)腦室注射miR-132模擬物后，大鼠神經(jīng)功能有所改善，F(xiàn)oxO3a表達(dá)減少，且表明miR-132在腦出血模型大鼠中的保護(hù)機(jī)制可能是通過靶向FoxO3a并抑制自噬發(fā)生。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清FoxO3a mRNA水平高是aSAH患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，推測FoxO3a的表達(dá)增加，導(dǎo)致多種自噬基因表達(dá)增加，加重細(xì)胞自噬，從而加重神經(jīng)損傷。本研究ROC曲線結(jié)果顯示，血清Cav-1、FoxO3a mRNA聯(lián)合預(yù)測aSAH患者預(yù)后的AUC為0.902，優(yōu)于單一指標(biāo)預(yù)測效能，說明監(jiān)測血清Cav-1、FoxO3a mRNA水平變化能夠?yàn)榕R床aSAH患者預(yù)后評(píng)估提供參考。本研究多因素分析還發(fā)現(xiàn)，改良Fisher分級(jí)高、Hung-Hess分級(jí)高是aSAH患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，與張?zhí)m等[28]研究結(jié)果一致。提示對(duì)于改良Fisher分級(jí)與Hung-Hess分級(jí)較高者臨床應(yīng)建立高危預(yù)警機(jī)制，加強(qiáng)干預(yù)、重點(diǎn)關(guān)注以降低預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，aSAH患者血清Cav-1呈低表達(dá)、FoxO3a mRNA呈高表達(dá)，二者與aSAH患者的預(yù)后情況有密切的聯(lián)系，二者聯(lián)合檢測能夠用于預(yù)后評(píng)估，對(duì)aSAH疾病的診治和預(yù)后有重大意義。但本研究仍存在一些不足，將擴(kuò)大樣本量研究，進(jìn)一步動(dòng)態(tài)檢測血清Cav-1、FoxO3a mRNA的水平變化，為aSAH的診治提供準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李長寶：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；宋保新：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；沈俊巖：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張?jiān)迄i：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，課題設(shè)計(jì)