趙亮星,趙卿宇,吳 彤,王 晗,薛 勇,沈 群
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 國家糧食產(chǎn)業(yè)(青稞深加工)技術(shù)創(chuàng)新中心 北京 100083)
電離輻射是指可以直接或間接地引起物質(zhì)原子和分子發(fā)生電離的輻射,主要包括帶電粒子的輻射和電磁波輻射,前者包括由正電子或負(fù)電子組成的β 射線和由氦核組成的α 射線,后者包括γ 射線、X 射線和中子射線[1-2]。生活在地球上的人類每時每刻都受到各種輻射的影響。根據(jù)人類生存環(huán)境中電離輻射的來源,可將輻射分為天然輻射和人工輻射源輻射。天然輻射是指來自人類生存的自然環(huán)境的電離輻射,如來自地面的放射以及來自外層空間的宇宙射線(0.20~1.24 mSv),世界人均天然輻射劑量約為2.4 mSv/年,我國人均輻射劑量約為2.3 mSv/年[3];人工輻射,如核工業(yè)工人受到的輻射劑量約1.5~2.75 mSv[4],醫(yī)療領(lǐng)域的醫(yī)用加速器的輻射劑量約2 mSv/次。1990 年國際放射防護(hù)委員會(ICRP)60 號建議書規(guī)定:職業(yè)性與個人照射在任何一年內(nèi)的有效劑量不得超過50 mSv[5]。胡國輝等[3]認(rèn)為1~10 mSv/年是公眾可以接受的輻射劑量的安全閾值區(qū)。另一方面,由于人體各組織對輻射的敏感程度不一樣,輻射劑量(Sv)=吸收劑量(Gy)×Q(生物組織加權(quán)系數(shù))。值得注意的是,放射治療(1~60 Gy)在治療疾病的同時也會損害機(jī)體的正常細(xì)胞、組織與功能,當(dāng)人類的全身吸收劑量達(dá)到2~7.5 Gy(嚙齒動物3~10 Gy)時會發(fā)生造血功能障礙,是導(dǎo)致輻射死亡的主要原因[6]。同時,輻射會對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成損傷,出現(xiàn)免疫力低下等情況,且免疫功能對造血功能的恢復(fù)有重要作用[7],促使照射后免疫功能的重建以及造血功能的恢復(fù)[8]。
青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.F.),又稱裸大麥、米大麥、元麥,是禾本科大麥屬一年生草本植物[9],主要種植于西藏、青海以及四川、云南等地的高海拔地區(qū),最高種植海拔可達(dá)4 500 m,是藏區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物。青稞富含多糖、多酚、生育酚和活性肽等生物活性物質(zhì)[10-11],具有提高免疫力[12],調(diào)節(jié)體重[13],抗菌[14],抗氧化[15],調(diào)節(jié)腸道健康[16],抗腫瘤[17]等作用。有研究表明,青稞多糖可通過促進(jìn)脾細(xì)胞DNA 和蛋白質(zhì)合成,發(fā)揮對輻射損傷小鼠免疫功能的保護(hù)作用[12]。青稞中含有的β-葡聚糖常用作生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑,可調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng),增加輻射損傷小鼠內(nèi)源多效造血干細(xì)胞的數(shù)量,發(fā)揮造血功能的保護(hù)作用[18]。然而,青稞是否對輻射損傷小鼠的造血功能有保護(hù)作用尚不明晰。
本研究以20%青稞飼料喂養(yǎng)4 周齡C57BL/6J 小鼠12 周后,通過4 Gy60Co-γ 射線照射小鼠,并繼續(xù)喂養(yǎng)2 周后觀察青稞對小鼠生長發(fā)育、骨髓有核細(xì)胞數(shù)及外周血象指標(biāo)等指標(biāo)的影響,探討青稞對60Co-γ 射線照射小鼠造血功能的保護(hù)作用。
SPF 級雌性4 周齡C57BL/6J 小鼠24 只,體重16~18 g,由維通利華提供。動物許可證編號:SCXK(京)2016-0006。
“藏青3 號”青稞粉,由山西東方亮生命科技股份有限公司提供。AIN-93G 基礎(chǔ)飼料,購于常州鼠一鼠二生物科技有限公司。
PBS 緩沖液,北京索萊寶科技有限公司;多聚甲醛,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;伊紅,美國Sigma 試劑公司;乙酸,德國Dr.Ehrenstorfer 公司。
3100 型自動血生化分析儀,日本日立公司;Eclipse E100 型顯微鏡,日本Nikon 公司;60Co-γ射線輻照源,北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院;EG1150H 型分體式石蠟包埋機(jī),德國Leica 公司;Centrifuge 5430R 型高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf 公司;BC-5000Vet 型獸用全自動血液細(xì)胞分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療股份有限公司。
1.3.1 青稞基本營養(yǎng)成分的測定及青稞飼料的制作 青稞中的蛋白質(zhì)根據(jù)GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法測定,脂肪根據(jù)GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中的方法測定,膳食纖維根據(jù)GB 5009.88-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》 中的方法測定,粗多糖根據(jù)SN/T 4260-2015 《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》 中的方法測定,β-葡聚糖根據(jù)NY/T 2006-2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》 中的方法測定,總多酚根據(jù)T/AHFIA 005-2018 《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定 分光光度法》 中的方法測定,灰分根據(jù)GB 5009.4-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中的方法測定,水分根據(jù)GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》 中的方法測定。
正常對照組(NCD)飼料和青稞干預(yù)組(WGB)飼料的主要營養(yǎng)素和熱量需保持一致,添加20%青稞粉后,相應(yīng)減少純化飼料中玉米淀粉、酪蛋白、麥芽糊精、大豆油、蔗糖的含量,飼料配方和供能比例見表1。WGB 組飼料由常州鼠一鼠二生物科技有限公司代為配比加工。
表1 飼料配方Table 1 Feed formula
1.3.2 動物實驗設(shè)計及分組 小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF 級動物房,飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照《實驗動物管理條件》進(jìn)行,實驗方案得到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利與動物實驗倫理審查委員會的批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號為:AW71302202-5-2。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分成3 組,每組8 只(n=8)。正常對照組(NCD 組;未經(jīng)過輻射暴露)與輻射對照組(IRC 組;經(jīng)輻射暴露)均采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),青稞干預(yù)組(BWG 組;經(jīng)輻射暴露)采用含20%青稞的飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)期間(12 周)小鼠自由進(jìn)食和飲水,每周稱重、記錄攝食量。12 周后,除NCD 組之外,IRC 組和BWG 組小鼠進(jìn)行一次性全身輻照4 Gy 劑量的60Co-γ 射線照射。照射后繼續(xù)喂養(yǎng)14 d,并于輻照后第14 天眼眶取血后頸椎脫臼處死小鼠,收集小鼠肝臟、脾臟、胸腺等組織進(jìn)行后續(xù)分析檢測。
1.3.3 實驗動物造模 除正常對照組小鼠外,其余所有小鼠分別置于單獨的有機(jī)玻璃(3 cm×3 cm×11 cm)中,一次性全身輻照4 Gy 劑量的60Coγ 射線,吸收劑量率為1 Gy/min,輻照時間為4 min。
1.3.4 骨髓有核細(xì)胞計數(shù) 參照趙釹君[19]的方法進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計數(shù)。
1.3.5 外周血象的檢測 分別于輻射前1 天,照射后第1,7 天和14 天尾靜脈取血20 μL,用獸用全自動血液細(xì)胞分析儀分析白細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血紅蛋白變化水平。
1.3.6 免疫臟器指數(shù)測定 輻照后第14 天,取出各組織器官,稱重,計算臟器指數(shù)。
臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。
1.3.7 骨髓和脾臟病理檢測 輻照后第14 天,參照冉媛媛[2]的方法進(jìn)行骨髓和脾臟病理檢測。
1.3.8 血生化指標(biāo)的檢測 輻照后第14 天后,將從眼眶采集的小鼠血液離心(3 000 r/min、15 min、4 ℃),獲得的上清液即為血清,使用自動血生化分析儀測定血清中的總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。
青稞基本營養(yǎng)成分如表2 所示。
表2 青稞粉的基本營養(yǎng)成分(g/100 g)Table 2 Basic nutrients of Hordeum vulgare L.var.nudum Hook.F.powder(g/100 g)
2.2.1 青稞對輻照小鼠體重及進(jìn)食量的影響 如圖1a 所示,在未經(jīng)過60Co-γ 射線照射的分組飼養(yǎng)期間,各組小鼠體重自然增加且無顯著性差異。60Co-γ 射線照射后,小鼠體重呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,其中IRC 組小鼠體重下降最為顯著,且后期體重恢復(fù)較慢。輻照后1 天,與NCD 組相比,IRC 組與BWG 組小鼠體重均顯著性降低;輻照后4 天,BWG 組小鼠體重明顯增長,與NCD 組相比無顯著差異(圖1b)。在未經(jīng)過60Co-γ 射線照射的分組飼養(yǎng)期間,各組小鼠攝食量無顯著差異(圖1c)。輻照1 周后,與NCD 組相比,經(jīng)輻照后小鼠進(jìn)食量雖顯著降低,但BWG 組小鼠進(jìn)食量顯著高于IRC 組;輻照2 周后,各組進(jìn)食量無顯著差異(圖1d)。圖1 說明60Co-γ 射線照射在一定程度上影響小鼠正常的飲食,從而導(dǎo)致一定時間內(nèi)小鼠體重呈下降狀態(tài),青稞干預(yù)能較快的恢復(fù)小鼠進(jìn)食量,并使體重恢復(fù)至正常。
圖1 飼養(yǎng)期間青稞對小鼠體重和攝食量的影響Fig.1 The effects of highland barley on the body weight and food intake of mice during rearing
2.2.2 青稞對輻照小鼠血生化指標(biāo)的影響 血生化指標(biāo)的穩(wěn)態(tài)也是觀測機(jī)體抗輻射損傷的重要指標(biāo),可以在一定程度上反映機(jī)體受輻照損傷的恢復(fù)程度[20]。如圖2 所示,輻照2 周后IRC 組小鼠的血清TC 水平顯著低于NCD 組小鼠,而BWG 組與NCD 組相比無顯著差異。盡管各組血清HDLC、LDL-C、TG 水平無顯著差異,但BWG 組各項指標(biāo)更接近NCD 組。
圖2 青稞對小鼠血生化指標(biāo)的影響Fig.2 The effects of highland barley on blood biochemistry index of mice
Liu 等[21]以350 mg/kg β-D-葡聚糖灌胃6 Gy碳離子輻照小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可緩解由輻射引起的體重下降。本研究中的青稞含有2.13 g/100 g β-葡聚糖(表2),小鼠平均每日攝入含有20%青稞的飼料2.8 g,相當(dāng)于每日平均攝入約477 mg/kg β-葡聚糖。由此可以推測青稞中的β-葡聚糖可能具有一定的改善輻射副作用的能力。
2.3.1 青稞對造血及血細(xì)胞的影響 造血系統(tǒng)主要由造血細(xì)胞與造血器官組成,骨髓產(chǎn)生的造血干細(xì)胞先分化形成各系定向祖細(xì)胞,后發(fā)育為各系幼稚細(xì)胞,進(jìn)一步分化、成熟為紅細(xì)胞、血紅蛋白以及白細(xì)胞等各類血細(xì)胞[7,22]。骨髓有核細(xì)胞數(shù)是指骨髓細(xì)胞中含有細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)量,體現(xiàn)機(jī)體造血功能狀態(tài)[19]。如圖3 所示,小鼠經(jīng)60Co-γ 射線照射后,小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)均有不同程度地減少。與IRC 組相比,BWG 組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)恢復(fù)顯著,與NCD 組無顯著差異。
圖3 青稞對小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)的影響Fig.3 The effects of highland barley on the number of nucleated cells in the bone marrow of mice
如圖4 所示,輻射后各組紅細(xì)胞數(shù)量快速下降,在輻射后第7 天下降到最低點,隨后逐漸上升;BWG 組紅細(xì)胞數(shù)量上升速度明顯高于IRC 組(圖4a)。血紅蛋白含量也呈現(xiàn)同樣的趨勢(圖4b)。對于白細(xì)胞數(shù)量而言,輻射后各組白細(xì)胞數(shù)量急劇減少,輻射后第1 天即到達(dá)最低點,之后緩慢上升,第14 天時BWG 組白細(xì)胞數(shù)量顯著高于IRC 組(圖4c)。小鼠淋巴細(xì)胞也呈現(xiàn)出與白細(xì)胞數(shù)量同樣的變化趨勢(圖4d)。
圖4 青稞對小鼠外周血象的影響Fig.4 The effects of highland barley on the peripheral blood of mice
紅細(xì)胞的功能是運輸氧、電解質(zhì)以及葡萄糖和氨基酸等新陳代謝所必須的營養(yǎng)物質(zhì),同時具有增強(qiáng)吞噬作用,提高防御能力,防止感染等作用[23]。白細(xì)胞的主要功能是防衛(wèi)作用,不同種類的白細(xì)胞以不同的方式參與機(jī)體的防御反應(yīng)。淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種,是體積最小的白細(xì)胞,主要存在于淋巴管中循環(huán)的淋巴液中,是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分,是淋巴系統(tǒng)幾乎全部免疫功能的主要執(zhí)行者[24]。本研究表明青稞干預(yù)可以在一定時間內(nèi)顯著促進(jìn)輻射小鼠紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞水平的恢復(fù),有助于小鼠免疫功能的恢復(fù)從而保全造血功能。
2.3.2 青稞對骨髓病理組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖5 所示,正常對照組小鼠的骨髓結(jié)構(gòu)完好,骨髓內(nèi)由紅系細(xì)胞及髓系細(xì)胞細(xì)胞填充,并可見分布的巨核細(xì)胞。經(jīng)60Co-γ 射線照射后,IRC 組小鼠胸骨骨髓出現(xiàn)明顯的造血細(xì)胞壞死,脂肪組織增生,紅系、髓系及巨核細(xì)胞數(shù)量明顯減少,BWG 組小鼠脂肪組織增生明顯少于IRC 組,造血細(xì)胞比例、形態(tài)和數(shù)量與NCD 組基本一致。同時,骨髓是白細(xì)胞發(fā)育、分化及執(zhí)行功能的場所[24]。圖5 結(jié)果表明青稞干預(yù)可以保護(hù)骨髓結(jié)構(gòu)以明顯恢復(fù)白細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮免疫功能,從而發(fā)揮保全機(jī)體造血功能的作用,與圖4 結(jié)果一致。
圖5 青稞對小鼠骨髓病理組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.5 The effects of highland barley on the histomorphology of bone marrow in mice
一些植物多糖具有增加小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的功效。例如青稞中提取純化的一種水溶性多糖能顯著增加小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量[25];當(dāng)歸多糖可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá),以延緩X 射線誘導(dǎo)的小鼠造血干細(xì)胞的衰老[26],分別以50,100,200 mg/kg 靈芝多糖灌胃經(jīng)5.0 Gy 劑量X 射線輻照小鼠,能有效減輕電離輻射引起血細(xì)胞的損傷程度,且具有劑量效應(yīng)關(guān)系[27];采用350,875 mg/kg 及1 750 mg/kg 酵母β-葡聚糖灌胃2 Gy 劑量碳離子束照射小鼠,發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖能有效恢復(fù)輻照小鼠外周血細(xì)胞的水平,并顯著增加輻照小鼠的骨髓有核細(xì)胞數(shù),從而發(fā)揮對造血功能的保護(hù)作用[28]。本研究中采用的青稞飼料中含有9.74 g/100 g 粗多糖(表2),相當(dāng)于每日平均攝入約2 181 mg/kg 多糖。由此可以推測青稞中的多糖尤其β-葡聚糖可通過保護(hù)骨髓組織和促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖,發(fā)揮對輻照損傷小鼠的骨髓造血器官的保護(hù)作用,促進(jìn)造血細(xì)胞的恢復(fù),保護(hù)輻照小鼠的造血功能。
2.4.1 青稞對輻照小鼠臟器指數(shù)的影響 臟器指數(shù)可以在一定程度上反映器官功能的強(qiáng)、弱,肝臟、胸腺與脾臟是機(jī)體重要的免疫器官,同時與機(jī)體造血功能緊密相關(guān)[29-30]。如圖6 所示,IRC 組小鼠肝臟臟器指數(shù)顯著高于NCD 組,脾臟臟器指數(shù)顯著低于NCD 組小鼠。BWG 組小鼠恢復(fù)肝臟及脾臟臟器指數(shù)的能力明顯優(yōu)于IRC 組。表明青稞干預(yù)可以顯著促進(jìn)輻照小鼠臟器指數(shù)的恢復(fù)。
圖6 青稞對小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.6 The effects of highland barley on the organ index of mice
2.4.2 青稞對脾臟病理組織形態(tài)學(xué)的影響 脾臟屬于周圍免疫器官,參與免疫細(xì)胞的成熟和分化,是免疫防御的重要場所[31]。如圖7 所示,正常組小鼠脾臟白、紅髓分界清晰,淋巴細(xì)胞分化完好,嗜堿性強(qiáng)。IRC 組小鼠脾臟白、紅髓分界不清,白髓結(jié)構(gòu)基本不可見,淋巴細(xì)胞減少。BWG 組小鼠脾臟白髓結(jié)構(gòu)恢復(fù),白髓淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增加,與2.2.1 節(jié)青稞有助于恢復(fù)輻照小鼠血細(xì)胞的結(jié)論相一致。印證青稞的預(yù)防性干預(yù)是通過防止輻照小鼠免疫功能損傷保全造血功能。
圖7 青稞全谷對小鼠脾臟病理組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.7 The effects of highland barley on the histomorphology of mouse spleen
有研究表明,植物中的多糖、多酚具有提高免疫力的作用。如青稞多糖能顯著提高免疫抑制小鼠的脾臟和胸腺重量指數(shù),從而改善免疫抑制小鼠的免疫功能[25]。安尚澤[32]指出,出芽短硬霉(A.Pullulans)菌株產(chǎn)生的細(xì)胞外分泌型β-葡聚糖可以提高小鼠免疫器官中胸腺和脾臟指數(shù)、血清和肝臟溶菌酶的活性、巨噬細(xì)胞的吞噬能力,減輕輻射對白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的殺傷,能促進(jìn)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞再生[33],促進(jìn)IL-1、IL-6、TNF-α 的合成和釋放,活化T 淋巴細(xì)胞[34],從而發(fā)揮提升免疫功能的功效。以50,100,200 mg/kg 狗棗獼猴桃多酚對6 Gy 劑量60Co-γ 射線照射小鼠進(jìn)行灌胃,發(fā)現(xiàn)多酚提高了輻射小鼠的臟器指數(shù)、機(jī)體的免疫力,保護(hù)小鼠的造血系統(tǒng)[35]。本研究采用的青稞含有0.33 g/100 g 多酚(表2),相當(dāng)于每日平均攝入74 mg/kg 多酚。推測青稞中含有的多糖尤其β-葡聚糖與多酚可能通過保護(hù)免疫器官功能損傷,促進(jìn)免疫細(xì)胞恢復(fù),使機(jī)體免疫功能得到保全,從而防止機(jī)體造血功能的損傷。
青稞的預(yù)防性干預(yù)對輻照損傷小鼠的體重、輻照后進(jìn)食量的影響較小,其可通過恢復(fù)免疫功能、血細(xì)胞水平、臟器指數(shù)與脾臟結(jié)構(gòu)來減少輻照引起的機(jī)體免疫功能的損傷,通過明顯恢復(fù)骨髓有核細(xì)胞數(shù)、外周血細(xì)胞數(shù),減輕骨髓結(jié)構(gòu)損傷,從而減少輻照引起的機(jī)體造血功能損傷。青稞屬于日常性飲食谷物,本研究對青稞應(yīng)用于輻射損傷的預(yù)防和輻射損傷后的恢復(fù)具有很強(qiáng)的現(xiàn)實意義。然而,本研究只探究了青稞干預(yù)對輻照小鼠造血系統(tǒng)的影響,研究仍然不夠深入,有待于進(jìn)一步開展更多的基礎(chǔ)研究闡明機(jī)理。