李軍 張秀清

(1菏澤市成武縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 菏澤 274200;2山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

缺血性腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)。腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管疾病重要病理過(guò)程〔1〕。紅景天苷是中藥紅景天提取的主要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、保護(hù)心腦功能、抗腫瘤等多種藥理功能。研究表明，紅景天對(duì)腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用〔2〕。然而關(guān)于紅景天苷在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制尚不清楚。氧葡萄糖剝奪/再恢復(fù)(OGD/R)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞是構(gòu)建體外腦缺血再灌注的常用模型。本研究通過(guò)構(gòu)建OGD/R損傷體外模型，探討紅景天苷對(duì)OGD/R損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞株 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC。藥品與試劑：紅景天苷(純度：≥98%，規(guī)格：100 mg/瓶，生產(chǎn)批號(hào)：20181467，阿拉丁生物試劑公司生產(chǎn))；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司生產(chǎn))；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海貝博生物公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染試劑盒(上海碧云天生物公司生產(chǎn))；聚偏氟乙烯膜。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)1抗體、核因子(NF)-κB抗體、NF-κB p65抗體、辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的IgG抗體(美國(guó)Millipore公司生產(chǎn))。儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品)；FACS流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn))；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn))。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)〔3〕SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、5% CO2。

1.3以SH-SY5Y細(xì)胞建立OGD/R細(xì)胞模型〔4〕將SH-SY5Y細(xì)胞接種于無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、95% N2、5 % CO2的培養(yǎng)氣室培養(yǎng)4 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至含95%空氣和 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4細(xì)胞處理和分組〔5〕SH-SY5Y細(xì)胞分為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、NF-κB信號(hào)通路激活劑(SC7273)+實(shí)驗(yàn)組2。正常組細(xì)胞使用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組細(xì)胞進(jìn)行OGD/R處理；實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2分別用10、20 μmol/L紅景天苷干預(yù)24 h，SC7273+實(shí)驗(yàn)組2使用20 μmol/L紅景天苷和1 μg/ml SC7273處理24 h后，進(jìn)行OGD/R處理。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率〔6〕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板。將SH-SY5Y細(xì)胞按照1.4方法分組處理，各孔加入20 μl MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)振蕩混勻，室溫放置10 min。在酶標(biāo)儀上讀取570 nm 處的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率(%)=〔實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值〕/〔對(duì)照孔A值-空白孔A值〕×100%。

1.6微量酶標(biāo)法檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH漏出率〔7〕將SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，并設(shè)置只含培養(yǎng)液的空白孔。各組細(xì)胞按照前述方法處理。對(duì)照組孔中加入10 μl LDH釋放試劑，其余孔中加入10 μl培養(yǎng)基。37 ℃孵育1 h后，使用多孔板離心機(jī)將培養(yǎng)板板以400 r/min離心5 min，取60 μl各孔上清液，移至新96孔板對(duì)應(yīng)孔中，并向各孔加入60 μl LDH檢測(cè)工作液，混勻后室溫下避光孵育30 min，在490 nm處測(cè)定各孔A值。LDH活性=〔實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值〕/〔對(duì)照組A值-空白孔A值〕×100%。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率〔8〕使用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化后，4℃下1 000 r/min離心3 min棄去上清液。然后加入1 ml的Annexin V緩沖液后重懸細(xì)胞，制成5×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。取1 ml細(xì)胞懸液，70%乙醇4℃固定24 h，加入5 μl PI 染色液避光孵育30 min，使用FACS流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8Western印跡檢測(cè)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)〔9〕使用含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，收集細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取總蛋白樣品煮沸變性后，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白條帶，并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。使用5%脫脂奶粉將膜室溫封閉1 h后，分別加入一抗(Sirt1抗體、NF-κB抗體、NF-κB p65抗體、GAPDH抗體)4℃孵育過(guò)夜，二抗(辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的IgG抗體)37℃孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影5 min，然后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率比較 與正常組〔(100.00±0.00)%〕比較，模型組細(xì)胞存活率〔(48.54±5.21)%〕顯著降低(P<0.05)；相比于模型組，實(shí)驗(yàn)組1〔(63.39±3.86)%〕和實(shí)驗(yàn)組2的存活率〔(76.17±6.42)%〕顯著升高(P<0.05)。

2.2各組SH-SY5Y細(xì)胞上清液LDH漏出率比較 模型組細(xì)胞上清液LDH漏出率〔(54.79±3.16)%〕顯著高于正常組〔(6.38±0.45)%，P<0.05〕；而實(shí)驗(yàn)組1〔(31.27±2.05)%〕和實(shí)驗(yàn)組2 LDH漏出率〔(23.65±2.81)%〕相比于模型組均顯著降低(均P<0.05)。

2.3各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率比較 模型組細(xì)胞凋亡率〔(14.52±1.17)%〕明顯高于對(duì)照組〔(5.29±0.37)%；P<0.05〕;實(shí)驗(yàn)組1〔(12.43±0.82)%〕、實(shí)驗(yàn)組2〔(7.54±0.66)%〕與模型組比較均顯著降低(均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡流式圖

2.4各組Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平比較 正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2 Sirt1蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.78±0.08，0.43±0.05，0.61±0.04，0.72±0.05；NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.32±0.05、0.66±0.08、0.52±0.03、0.36±0.03；NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)分別為0.31±0.03，0.65±0.05，0.43±0.03，0.34±0.02。模型組與正常組比較，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2與模型組比較，Sirt1、NF-κB及NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。表明紅景天苷可能通過(guò)顯著抑制Sirt1/NF-κB信號(hào)通路抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

2.5SC7273逆轉(zhuǎn)紅景天苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響 與實(shí)驗(yàn)組2〔(75.34±6.79)%〕相比，SC7273+實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞存活率〔(42.31±3.79)%〕顯著下降(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組2 LDH漏出率〔(22.16±3.01)%〕和細(xì)胞凋亡率〔(6.89±0.79)%〕均顯著低于SC7273+實(shí)驗(yàn)組2〔(48.97±4.67)%、(15.31±1.63)%，均P<0.05〕，表明SC7273逆轉(zhuǎn)了紅景天苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率、LDH漏出率和凋亡率的影響。見圖3。

2.6SC7273逆轉(zhuǎn)紅景天苷對(duì)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平 實(shí)驗(yàn)組2和SC7273+實(shí)驗(yàn)組2的Sirt1蛋白表達(dá)量分別為0.77±0.07和0.32±0.04；NF-κB蛋白表達(dá)量分別為0.35±0.04和0.80±0.09；NF-κB p65蛋白表達(dá)量分別為0.33±0.04和0.70±0.08。與實(shí)驗(yàn)組2相比，SC7273+實(shí)驗(yàn)組2 Sirt1、NF-κB和NF-κB p65蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖4。表明SC7273可逆轉(zhuǎn)紅景天苷對(duì)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 兩組細(xì)胞凋亡流式圖

圖4 兩組細(xì)胞內(nèi)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)，中藥活性成分對(duì)腦缺血再灌注神經(jīng)損傷的保護(hù)作用引起了越來(lái)越多的關(guān)注。紅景天苷已被證實(shí)通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)腦缺血再灌注神經(jīng)損傷〔10〕。本研究結(jié)果提示紅景天苷可能通過(guò)增加SH-SY5Y細(xì)胞存活率和抑制氧化應(yīng)激的途徑發(fā)揮其治療作用。有研究報(bào)道紅景天苷可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的途徑減輕缺血再灌注帶來(lái)的損傷〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率增加，而紅景天苷可逆轉(zhuǎn)OGD/R對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，這與先前的研究結(jié)果一致〔11〕。

Sirt1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，介導(dǎo)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)。據(jù)報(bào)道，Sirt1在缺血性腦血管病患者血漿中表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞惡化程度呈正相關(guān)〔12〕。此外，Sirt1去乙酰化后能夠影響NF-κB激活，Sirt1/NF-κB信號(hào)通路已被證實(shí)在腦缺血再灌注損傷機(jī)制發(fā)揮重要作用〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可顯著削弱OGD/R對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt1、NF-κB和NF-κB p65蛋白的表達(dá)的影響，表明紅景天苷可能通過(guò)抑制Sirt1/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SC7273可扭轉(zhuǎn)紅景天苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并逆轉(zhuǎn)了紅景天苷對(duì)Sirt1/NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。

綜上，紅景天苷可通過(guò)抑制Sirt1/NF-κB信號(hào)通路減輕OGD/R對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷。