張彐寧 靳曉飛 高維娟

(河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

腦卒中的發(fā)病類型主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中總數(shù)的70%～80%〔1〕。缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要與能量代謝障礙、活性氧增多、鈣超載、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬、高能磷酸化合物生成障礙、興奮性氨基酸毒性作用等多種內(nèi)外因素相關(guān)〔2〕。各因素之間互相作用，最終導(dǎo)致了神經(jīng)功能破壞、腦梗死灶的形成。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能異常是缺血性腦卒中病理進(jìn)程中的關(guān)鍵一環(huán)。線粒體功能異常，可引起促凋亡相關(guān)因子表達(dá)增強(qiáng)，激活線粒體凋亡通路，引起缺血性腦卒中神經(jīng)功能障礙〔3〕。本文就p53/細(xì)胞色素(Cyt)C/凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用進(jìn)行綜述。

1 線粒體凋亡通路與缺血性腦卒中

1.1細(xì)胞凋亡的概念 1842年，德國科學(xué)家Carl Vogt首先對凋亡進(jìn)行了描述。1885年，解剖學(xué)家Walther Flemming做出了程序性細(xì)胞死亡的精準(zhǔn)描述。直到1965年，細(xì)胞凋亡才被學(xué)術(shù)界重新重視，當(dāng)時(shí)利用電鏡技術(shù)，明確地區(qū)分凋亡細(xì)胞與創(chuàng)傷性死亡的細(xì)胞。1972年病理學(xué)家Kerr等將自然細(xì)胞死亡過程定義為凋亡。凋亡是指在體內(nèi)外因素的誘導(dǎo)下，由嚴(yán)格和復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控而發(fā)生的自主性細(xì)胞有序死亡過程〔4〕，細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞縮小、細(xì)胞質(zhì)膜泡狀化、核固縮、DNA裂解為片段，最后胞膜下陷分割包裹胞質(zhì)及細(xì)胞器，最終形成凋亡小體，被周圍的巨噬細(xì)胞所吞噬，從而維持生物體的正常代謝過程和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

1.2線粒體凋亡通路的發(fā)生過程 線粒體凋亡通路是一種典型的caspase依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式，線粒體作為一個(gè)儲(chǔ)存器，它儲(chǔ)存了較多的促凋亡蛋白如CytC、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、核酸內(nèi)切酶G及caspases-2，3，8，9酶原等〔5〕，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部凋亡誘導(dǎo)因素及p53等外部凋亡誘導(dǎo)因素刺激時(shí)，引起線粒體自身應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，CytC等促凋亡蛋白由線粒體膜間隙釋放入胞質(zhì)，在dATP存在的情況下立即與Apaf-1結(jié)合，使Apaf-1暴露自身的caspase募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，同時(shí)與Procaspase-9的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成凋亡酶體復(fù)合物，即凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，引起caspase連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致caspase-3，caspase-6，caspase-7等下游凋亡蛋白逐一被激活，成為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，進(jìn)而激活和裂解核酸內(nèi)切酶、核纖層蛋白酶等的作用底物，最終降解細(xì)胞骨架，致細(xì)胞凋亡〔6〕。

1.3線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用 線粒體是真核生物進(jìn)行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，以ATP形式為機(jī)體提供大部分能量，是整個(gè)機(jī)體的發(fā)電廠〔7〕。腦是對缺血缺氧最敏感、耐受能力最差的器官，由于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，大腦具有高能量需求，而大腦的能量儲(chǔ)備低，主要依賴于葡萄糖的有氧氧化，高ATP轉(zhuǎn)換又使大腦易受缺血性損傷的影響〔8〕。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，線粒體受損，能量合成障礙，腦組織ATP迅速減少，位于細(xì)胞膜的離子泵功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，線粒體腫脹，使受損線粒體釋放出許多的促凋亡物質(zhì)，從而激活線粒體凋亡通路，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

Li等〔9〕從出生1～2 d的SD大鼠幼仔中分離提取原代神經(jīng)元，建立氧糖剝奪(OGD)模型，模擬了缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷環(huán)境，在細(xì)胞水平，觀察了線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中神經(jīng)元凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元活性顯著降低，CytC與caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，表明在缺血性腦卒中的病理進(jìn)程中激活了線粒體凋亡通路。Bao等〔10〕采用OGD誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環(huán)境，應(yīng)用CCK-8，流式細(xì)胞術(shù)和Western印跡對OGD誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞損傷進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組線粒體凋亡通路相關(guān)因子p53，Bax，cleaved-caspase-3/-9表達(dá)均顯著增高。表明線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。Xie等〔11〕通過建立SD大鼠腦缺血再灌注損傷模型，采用在體實(shí)驗(yàn)?zāi)M缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷環(huán)境，觀察了p53介導(dǎo)的Bax/CytC/caspase-3線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中大鼠中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦梗死體積較大并伴有嚴(yán)重腦水腫，Nissl、TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)量增多，線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bax、CytC、caspase-3表達(dá)顯著增高。以上研究都表明了缺血性腦卒中后明顯激活了線粒體凋亡通路，引起了缺血區(qū)域腦組織神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。

2 p53/CytC/Apaf-1與線粒體凋亡通路

線粒體凋亡通路是caspase依賴性的重要細(xì)胞凋亡機(jī)制，以線粒體為靶的蛋白分子以不同的途徑影響線粒體的功能，使細(xì)胞最終凋亡。它們有的在線粒體膜上形成孔道致使線粒體腫脹；有的增加線粒體膜的通透性，使凋亡效應(yīng)因子從線粒體漏出；有的通過降低線粒體膜電位使其通透性增加，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。而p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路就是通過增加線粒體膜的通透性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

2.1p53的結(jié)構(gòu)與作用 p53是一種腫瘤抑制基因，由16～20 kb組成，是一個(gè)由393個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，相對分子質(zhì)量約53，簡稱p53。p53是目前公認(rèn)的促凋亡基因，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。p53可通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Puma、Noxa、Bid、PTEN、Fas/CD95，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；也可直接在細(xì)胞質(zhì)膜聚集激活促凋亡蛋白Bax而觸發(fā)細(xì)胞凋亡；還可以和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl 形成復(fù)合物直接誘導(dǎo)線粒體外膜通透性增加，導(dǎo)致CytC釋放〔12〕，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

p53在缺血性腦卒中引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用，它是抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)〔13，14〕。大腦缺血缺氧均可促進(jìn)p53表達(dá)，通過多種形式引起促凋亡蛋白Bax表達(dá)增多，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔15〕。Young Park等〔16〕應(yīng)用SH-SY5Y細(xì)胞，建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)模型，模擬缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷環(huán)境，探討金納米顆粒對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，給予OGD/R處理后，模型組細(xì)胞p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降，當(dāng)給予金納米顆粒治療后，p53、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著提高，并且SH-SY5Y細(xì)胞活性明顯升高，有效發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，表明p53介導(dǎo)的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進(jìn)程中扮演著重要角色。

2.2CytC的結(jié)構(gòu)與作用 CytC是分子量為13 kD左右的核編碼蛋白，由105個(gè)氨基酸組成，是水溶性線粒體膜蛋白。生理狀態(tài)下，CytC存在于線粒體的內(nèi)膜外側(cè)，無法穿過線粒體外膜釋放至胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號因子刺激后，CytC在唯BH3結(jié)構(gòu)域蛋白輔助下易位到線粒體膜上，經(jīng)線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在dATP存在的條件下，與胞質(zhì)中的Apaf-1蛋白相結(jié)合，誘導(dǎo)caspase-9活化，引起細(xì)胞凋亡〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，CytC從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)是多種細(xì)胞凋亡方式的共同表現(xiàn)，它是線粒體凋亡通路中不可缺少的重要因子〔18〕。

當(dāng)細(xì)胞受到缺血、缺氧等外界條件刺激時(shí)，促凋亡因子將通過破壞線粒體外膜，促使活性氧、自由基等信號因子刺激線粒體內(nèi)膜小孔開放，使細(xì)胞自身發(fā)生應(yīng)激性改變，水和溶質(zhì)等小分子物質(zhì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致線粒體膨脹，內(nèi)膜的膨脹導(dǎo)致外膜的破裂，破壞了線粒體膜完整性，使包括CytC在內(nèi)的多種凋亡蛋白釋放入胞質(zhì)〔19〕，最終引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。Zhao等〔20〕應(yīng)用小鼠海馬神經(jīng)元OGD和小鼠全腦缺血性損傷模型，在細(xì)胞和動(dòng)物水平，分別探討了Ngn2對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予OGD和全腦缺血處理后，模型組CytC的釋放明顯增多，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)明顯增多，給予Ngn2處理后，CytC的釋放顯著減少，Bax、caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)顯著降低，有效減輕了OGD誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元損傷和腦缺血小鼠腦梗死體積，表明CytC介導(dǎo)的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。

2.3Apaf-1的結(jié)構(gòu)與作用 Apaf-1是一種分子量為130 kD的胞質(zhì)蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中，包含1 194個(gè)氨基酸殘基。按照自身結(jié)構(gòu)的不同Apaf-1分為3種結(jié)構(gòu)域：CARD結(jié)構(gòu)域、CED-4同源結(jié)構(gòu)域、WD-40結(jié)構(gòu)域。當(dāng)CytC和dATP存在的條件下，Apaf-l構(gòu)象發(fā)生改變，WD-40結(jié)構(gòu)域移位，暴露其CARD結(jié)構(gòu)域，通過CARD-CARD親和作用與Procaspase-9的CARD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，誘導(dǎo)caspase-9的活化，從而啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)〔21，22〕。

Apaf-1作為線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路中的重要因子與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，它是形成凋亡體的核心，在激活caspase級聯(lián)反應(yīng)中起樞紐作用〔23，24〕。Vaibhav等〔25〕通過建立腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環(huán)境，探討了姜油酮對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用。模型組大鼠腦梗死體積明顯增加，線粒體損傷顯著，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)明顯升高。給予姜油酮處理后，促凋亡蛋白Apaf-1、Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)顯著降低，大鼠腦梗死體積明顯減小，研究表明，表明了Apaf-1介導(dǎo)線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。

2.4p53/CytC/Apaf-1介導(dǎo)線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中的作用 p53被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡連鎖反應(yīng)中的第一個(gè)關(guān)鍵因素，在調(diào)節(jié)缺血缺氧引起的細(xì)胞損傷時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用〔13,26〕。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后，線粒體功能障礙，此時(shí)，p53則在細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生聚集，激活了多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白Bax〔27〕，使得Bax與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，從而介導(dǎo)CytC的釋放，p53也可以直接作用于線粒體膜，誘導(dǎo)CytC釋放入胞質(zhì)，與胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合，從而激活下游凋亡蛋白caspase-9/-3，引起caspase的級聯(lián)反應(yīng)〔18〕，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Gao等〔28〕應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠靶向抑制Apaf-1的表達(dá)，初步觀察了抑制Apaf-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路對缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因小鼠靶向抑制Apaf-1，顯著降低了胞質(zhì)中CytC的表達(dá)，抑制了凋亡蛋白caspase-9/-3活化，有效改善了缺血性腦卒中小鼠神經(jīng)功能障礙。Xie等〔11〕采用大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中腦損傷環(huán)境，并注射p53抑制劑(PFT-α)，觀察了p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路，在缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)損傷中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯提高，給予p53抑制劑后，p53、Bax、CytC、caspase-3的蛋白表達(dá)量明顯降低，大鼠腦梗死體積明顯減小，表明了抑制p53/CytC/Apaf-1線粒體凋亡通路的激活，對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，給缺血性腦卒中的治療具有重要意義。Wen等〔29〕利用SD大鼠建立腦缺血再灌注損傷模型，模擬缺血性腦卒中損傷環(huán)境，觀察了缺血性腦卒中大鼠腦梗死體積、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率及p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表達(dá)，探討了NDRG4基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和預(yù)防腦缺血再灌注損傷中的新作用，研究發(fā)現(xiàn)， NDRG4基因可以抑制p53的表達(dá)和活性，從而降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，減少腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，降低p53、Bax、Bcl-2、CytC和caspase-3的蛋白表達(dá)。此外，Kotipatruni等〔30〕研究發(fā)現(xiàn)，NDRG4基因的下調(diào)可以激活p53，增加Bax的表達(dá)及轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體膜，促使CytC釋放，從而活化線粒體凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這些都提示了p53/CytC/Apaf-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中病理進(jìn)程中扮演了重要角色。如果能夠有效抑制p53/CytC/Apaf-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，將對缺血性腦卒中的治療提供重大幫助。

3 小結(jié)與展望

缺血性腦卒中是一種臨床上常見腦血管疾病，尤其高發(fā)于60歲以上老年人。缺血性腦卒中發(fā)生后，可引起線粒體功能障礙，導(dǎo)致線粒體腫脹，線粒體膜通透性增加，促凋亡相關(guān)因子表達(dá)增強(qiáng)，引發(fā)線粒體途徑細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡通路在缺血性腦卒中發(fā)生后被激活，在腦缺血區(qū)域引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，破壞神經(jīng)元功能，造成嚴(yán)重的腦組織損傷。p53/CytC/Apaf-1是線粒體凋亡通路中的經(jīng)典途徑，在缺血性腦卒中神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。p53是一種特異性的轉(zhuǎn)錄因子，作為凋亡發(fā)生的起始因素，可誘導(dǎo)多種促凋亡蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體膜，使其通過線粒體膜通道轉(zhuǎn)換孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，凋亡相關(guān)因子CytC就是其中一種促凋亡因子，它是線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵一環(huán)，其進(jìn)入胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1的羧基端結(jié)合，使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-CytC-Procaspase-9多聚復(fù)合體，進(jìn)而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)腦缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而抑制p53/CytC/Apaf-1介導(dǎo)的線粒體凋亡通路，可有效減輕腦缺血損傷，對于防治缺血性腦卒中具有重要意義。