劉敬敬，陳 雷

(廈門市兒童醫(yī)院，福建 廈門 361006)

肺炎鏈球菌(S.pn)又稱肺炎雙球菌，可引起急性肺泡炎癥性疾病，健康人鼻咽部70%以上存在S.pn。正常情況下S.pn無致病性，當(dāng)機(jī)體防御功能減退、抗病能力減弱、球菌毒力和致病力增強(qiáng)時(shí)可引發(fā)伴有寒戰(zhàn)高熱、咳嗽、咯血痰、胸痛、呼吸困難等癥狀的肺炎，嚴(yán)重情況下可發(fā)展為腦膜炎、敗血癥等侵入性疾病[1]。在機(jī)體內(nèi)，S.pn 可加速活化被抗原提呈細(xì)胞(APC)，將抗原肽遞呈給T 細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。肺炎鏈球菌熱休克蛋白40又稱Dna J，是分子伴侶的一種，該蛋白為S.pn的一種毒力因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制[2]。樹突細(xì)胞(DCs)是機(jī)體專職呈遞抗原的細(xì)胞，分為未成熟DCs(iDCs)和成熟DCs(mDCs)兩大類，其中mDCs與促炎性細(xì)胞因子水平、病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3]。研究表明，CD11c是一類高表達(dá)于DCs的表面分子,DCs及B淋巴細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ型分子(MHCⅡ)在細(xì)胞完成抗原呈遞，活化CD4+的T淋巴細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Shin等發(fā)現(xiàn)，iDCs成熟過程中，MHCⅡ會(huì)從晚期內(nèi)含體和溶酶體中釋放并遷移至質(zhì)膜，可見，在iDCs中MHCⅡ主要存在于細(xì)胞內(nèi)，而在mDCs中卻大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)膜上。Chan等報(bào)道，隨著DCs的成熟，IL-12的分泌是增加的，IL-12不僅可以促進(jìn)DCs數(shù)量的增加，而且還會(huì)促進(jìn)成熟[4-5]。研究表明，DCs細(xì)胞質(zhì)膜上MHCⅡ和共刺激分子含量的增加意味著活力的增強(qiáng)，可促進(jìn)DCs的成熟[6]。Dna J與DCs的成熟相關(guān)，但在成熟過程中的免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚。本文通過試驗(yàn)研究分析DnaJ誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源DCs成熟過程中細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況，探討DnaJ在機(jī)體免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象:我院檢驗(yàn)科體檢的0～18歲健康兒童。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2主要儀器及試劑:電子天平(梅特勒-托利多，ME203E/02);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，BC-J80S)；流式細(xì)胞儀(貝克曼公司 FACS，Calibur); 胎牛血清(Gibco,1640958)；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(上海微科生物，S00000L0500)；重組小鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(上海恒斐生物科技有限公司，415-ML-050)；重組小鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4)(上海玉博生物,CYT-282)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD11c抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)、CD11c、CD86抗體、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒均來源于北京博奧森生物科技有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1Dna J的制備:①肺炎鏈球菌rHSP40基因合成：密碼子優(yōu)化軟件MaxCodon TM Optimization Program (V13)對(duì)提供的肺炎鏈球菌熱休克蛋白氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化，采用全基因合成方法，限制性酶切位點(diǎn) NdeⅠ和HindⅢ將肺炎鏈球菌rHSP40基因插入到表達(dá)載體pET30a中，酶切法和測(cè)序確認(rèn)最終表達(dá)載體的準(zhǔn)確性。②肺炎鏈球菌rHSP40蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：將構(gòu)建的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)到 Top10 克隆菌株和 BL21(DE3)表達(dá)菌株中，通過異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)肺炎鏈球菌rHSP40。③肺炎鏈球菌rHSP40蛋白純化：通過親和層析(Ni-IDA 樹脂)純化肺炎鏈球菌rHSP40。④肺炎鏈球菌rHSP40蛋白祛除內(nèi)毒素：最后通過對(duì)甲氧基芐基(PMB)柱去除內(nèi)毒素，獲得目標(biāo)蛋白。

1.3.2DCs的誘導(dǎo)成熟:①外周血單核細(xì)胞分離：抽取兒童外周血2 ml于負(fù)壓采血管，按照外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒說明書提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。②DCs培養(yǎng)： 10%胎牛血清(FBS)的1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為15ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)濃度為5×105/ml后接種于6孔培養(yǎng)孔板，每孔體積為4 ml。37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，輕輕晃動(dòng)六孔板，吸棄培養(yǎng)液、懸浮、半懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，每孔加入含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為15 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)4 ml繼續(xù)培養(yǎng)3 d。③DCs誘導(dǎo)成熟：收集培養(yǎng)3 d后體系中的懸浮及半懸浮細(xì)胞，1 500 r/min，離心5 min，PBS洗滌，將細(xì)胞接種于六孔板，當(dāng)細(xì)胞濃度為 1×107/ml，用15 μg/ml的肺炎鏈球菌rHSP40對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為5 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，胰酶消化收集細(xì)胞。

1.3.3細(xì)胞表面分子檢測(cè)：將FITC標(biāo)記的抗CD11c抗體、PE標(biāo)記的抗HLA-DR、CD11c、CD86抗體按照使用說明書進(jìn)行稀釋。收集陰性對(duì)照組細(xì)胞及rHSP40刺激組細(xì)胞1×107個(gè)，PBS洗滌1遍，分別加入稀釋后抗體，4℃冰箱避光孵育30 min。PBS洗滌2遍，離心除去未吸附抗體。1 ml滅菌移液槍輕柔吹打兩組細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1肺炎鏈球菌rHSP40基因合成與構(gòu)建情況：瓊脂糖電泳確認(rèn)質(zhì)?；螂娪緱l帶及目的基因電泳條帶，見圖1目的基因質(zhì)量控制結(jié)果、圖2目的基因構(gòu)建結(jié)果。

注:泳道1為質(zhì)粒電泳的基因片段，泳道2為目的基因DT3198電泳基因片段，泳道3為DNA Marker電泳條帶

圖2 目的基因構(gòu)建結(jié)果圖解

2.2肺炎鏈球菌rHSP40誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果的鑒定：考馬斯亮莉染色法對(duì)肺炎鏈球菌rHSP40蛋白染色鑒定，脫色至背景清晰確定最佳誘導(dǎo)條件。加終濃度0.2 mmol/L IPTG，15℃誘導(dǎo)16 h后可作為誘導(dǎo)條件，用于肺炎鏈球菌rHSP40放大培養(yǎng)，見圖3。

泳道M:蛋白Marker,泳道 0:陰性對(duì)照，泳道1:15℃誘導(dǎo) 16 h，泳道2:37℃誘導(dǎo) 16 h

2.3肺炎鏈球菌rHSP40蛋白純化：SDS-PAGE 分析經(jīng) Ni-IDA 親和層析純化，收集純度相對(duì)較高的條帶8～10中，將其透析到 1×PBS(pH值8.0)中，下一步嘗試 PMB 柱去除內(nèi)毒素，分析結(jié)果見圖4。

泳道 M:蛋白 Marker；泳道 1:全菌破菌離心后上清；泳道 2:上清同 Ni-IDA 孵育后流出液；泳道 3～7:50 mmol咪唑的洗脫組分；泳道8～10:100 mmol咪唑的洗脫組分；泳道11～13:300 mmol咪唑的洗脫組分

2.4PMB柱去除內(nèi)毒素結(jié)果：通過凝膠法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒測(cè)定，得出內(nèi)毒素去除的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果濃度：C=3.18 mg/ml(Bradford法測(cè)定原始數(shù)據(jù)),本批鱟試劑靈敏度：λ=0.25 EU/ml；樣品中所含內(nèi)毒素限值：L=1 EU/μg;最大稀釋倍數(shù):MVD= C*L/λ;實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：Chaperone蛋白的內(nèi)毒素水平<1 EU/μg，結(jié)果如下：稀釋倍數(shù)10、100、1 000結(jié)果為凝固；稀釋倍數(shù)12 000、16 000時(shí)，結(jié)果為未凝固。

2.5肺炎鏈球菌rHSP40刺激后的細(xì)胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86表達(dá)情況：肺炎鏈球rHSP40刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含刺激因子濃度為5 ng/ml的rmGM-CSF和rmIL-4)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面分子檢測(cè)CD11c、HLADR、CD80及CD86表達(dá)情況，結(jié)果如下圖5，結(jié)果顯示肺炎鏈球菌HSP40刺激后的細(xì)胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86高表達(dá)。見圖5。

圖5 CD11c、HLADR、CD80及CD86表達(dá)情況

3 討論

DCs是機(jī)體最主要的專職APC。有研究表明，根據(jù)DCs的成熟狀態(tài)可以將其分為未成熟DCs(iDCs)和成熟DCs(mDCs)，CD11c是一類高表達(dá)于DCs的表面分子[7-9]。DCs及B淋巴細(xì)胞表面的HLA-DR在細(xì)胞完成抗原呈遞，活化CD4+的T淋巴細(xì)胞中發(fā)揮重要作用[10-12]。Shin等發(fā)現(xiàn)，iDCs成熟過程中，HLADR會(huì)從晚期內(nèi)含體和溶酶體中釋放并遷移至質(zhì)膜，可見，在iDCs中HLADR主要存在于細(xì)胞內(nèi)，而在mDCs中卻大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)膜上[13-15]。同時(shí)，細(xì)胞表面的共刺激分子CD80和CD86是活化效應(yīng)T細(xì)胞的重要第二信號(hào)，也與DCs的成熟相關(guān)。DCs細(xì)胞質(zhì)膜上HLADR和共刺激分子含量的增加意味著細(xì)胞活力的增強(qiáng)[16-17]。研究表明，在感染應(yīng)激條件下 S.pn 高表達(dá)HSP40以適應(yīng)外界環(huán)境變化，HSP40是S.pn 重要的毒力因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制[18]。但HSP40在單核細(xì)胞來源的DCs成熟過程中的研究至今在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本課題旨在通過研究HSP40在誘導(dǎo)兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的DCs成熟過程中細(xì)胞表面分子分泌情況，以期指導(dǎo)兒童重癥肺炎的治療。

研究通過肺炎鏈球菌rHSP40基因合成與構(gòu)建獲得準(zhǔn)確的表達(dá)載體，將構(gòu)建好的含有肺炎鏈球菌rHSP40基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)肺炎鏈球菌rHSP40，之后通過親和層析(Ni-IDA樹脂)純化肺炎鏈球菌rHSP40，最終通過PMB柱去除內(nèi)毒素獲得最終目標(biāo)蛋白。研究通過培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)完成后接種于6孔培養(yǎng)板，分為陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示肺炎鏈球菌HSP40刺激后的細(xì)胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86高表達(dá)，表明肺炎鏈球菌HSP40可誘導(dǎo)DCs成熟。

綜上所述，肺炎鏈球球菌HSP40可通過上調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞表面分子CD11c、HLADR、CD80及CD86表達(dá)，誘導(dǎo)DCs成熟。研究通過探討肺炎鏈球菌HSP40(HSP40 )在DCs成熟過程中的作用，加強(qiáng)肺炎鏈球菌的致病機(jī)制的進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，從而為更好地闡明肺炎鏈球菌致病機(jī)制及研發(fā)新型疫苗作鋪墊。