崔 醒，朱秋勁，侯 瑞，萬 婧,3,*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

鐮刀菌屬真菌可以侵染多種農(nóng)作物和經(jīng)濟作物，引起小麥、大麥和燕麥的赤霉病和莖基腐病以及玉米的穗腐病等[1]。鐮刀菌侵染農(nóng)作物后分泌的單端孢霉烯族毒素是目前糧食及食品加工產(chǎn)品中主要的真菌毒素來源。這些真菌疾病一直威脅著全球糧食的產(chǎn)量和質(zhì)量（受感染的谷物含有毒性很強的嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）），也是制約我國及世界糧食安全和食品安全的重要因素。被感染的谷物在收獲、貯藏運輸或加工過程若遭遇高溫高濕條件則可能出現(xiàn)真菌的二次生長，所產(chǎn)生的毒素由于穩(wěn)定性較高會經(jīng)由加工鏈進入食品或飼料，嚴(yán)重危害人畜健康，如玉米赤霉烯酮可使豬發(fā)生雌性激素亢進癥，單端孢霉素類則阻礙蛋白質(zhì)合成而引起動物嘔吐、腹瀉和拒食[2]。世界范圍內(nèi)的真菌污染導(dǎo)致約20%的田間減產(chǎn)和約10%的采后損傷。據(jù)美國疾病控制中心估算，全球約有超過450萬 人長期暴露于高真菌毒素含量的食物[3]。由于真菌及其毒素的污染無法完全從田間去除，因此，開發(fā)積極有效的采后真菌和真菌毒素控制措施是農(nóng)產(chǎn)品和食品工業(yè)中亟待解決的重要問題。目前，我國用于控制農(nóng)產(chǎn)品采后真菌及真菌毒素污染的方法主要是人工合成的殺菌劑，如吡咯苯類、咪唑類和硫氰酸類等，但因受到其化學(xué)殘留安全性、環(huán)境降解周期長，尤其是過度使用造成的真菌耐藥性問題凸顯而逐漸被禁用，迫使農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)積極探索毒副作用小、環(huán)境友好且具有新型作用機制的抗菌劑或殺菌劑。植物精油因其高效的廣譜抗菌性、良好的生物降解性和食品安全性而成為化學(xué)合成殺菌劑最熱門的候選之一[4]。植物精油是芳香植物為進行自我防御而產(chǎn)生的次級代謝物，通過在花、芽、葉和樹皮等部位提取而得到的揮發(fā)性物質(zhì)的復(fù)雜混合物。由于精油的化學(xué)組分復(fù)雜且異變（易受生長環(huán)境和提取條件的影響），極大地削弱了精油的生物活性且使闡明其抑菌機制變得困難。團隊前期篩選出富含苯酚類化合物如丁香酚、百里香酚和香芹酚的植物精油（丁香精油和百里香精油）能高效抑制禾谷鐮刀菌的生長和產(chǎn)毒[5-6]。因此，可以從精油中分離出丁香酚、百里香酚和香芹酚單獨研究其對禾谷鐮刀菌的抑菌作用和機制。

植物精油及其活性成分抑制微生物的機制主要包括：1）損傷真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜[7]；2）使菌絲體DNA、RNA、脂類和蛋白質(zhì)等生物合成受到抑制，相關(guān)基因不能表達(dá)，進而使其失去對代謝的調(diào)節(jié)控制以及自我復(fù)制的正常進行，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]；3）損傷真菌的細(xì)胞能量代謝途徑[9]；4）對真菌產(chǎn)毒基因的抑制作用[10]。盡管植物精油及其活性成分的抗菌機制在細(xì)胞水平被廣泛報道，但在對禾谷鐮刀菌的抑制機制在基因水平的闡明還很匱乏。禾谷鐮刀菌全基因組序列的公布以及單端孢霉烯族毒素合成基因、基因簇和生物合成途徑的不斷挖掘為基因水平研究植物精油及其活性成分對禾谷鐮刀菌的作用機制提供了便利。目前已經(jīng)明確單端孢霉烯族毒素的生物合成至少涉及到3個基因家族，分別為Tri5基因簇、Tri1-Tri16基因簇和Tri101基因簇[11]。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可研究苯酚類化合物對禾谷鐮刀菌細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平，包括編碼和非編碼蛋白RNA的影響及其差異[12-13]。綜上所述，在前期工作的基礎(chǔ)上，以具有高效抗菌活性的3種苯酚類植物精油活性成分丁香酚、香芹酚和百里香酚為研究對象，明確其對禾谷鐮刀菌菌絲生長、孢子萌發(fā)和DON合成的抑制效應(yīng)，從細(xì)胞水平研究其對禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)容物和能量代謝等生理影響，最后通過RNA-Seq測序從轉(zhuǎn)錄組水平探明3 類苯酚類化合物抑制禾谷鐮刀菌的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）由貴州大學(xué)林學(xué)院提供。

丁香酚、香芹酚和百里香酚（食品級≥98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）及其他試劑 貴州慕為美科技有限公司；KA08304H DON殘留酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒 北京勤邦生物技術(shù)有限公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ATP含量檢測試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max 190光吸收型酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；GTR16-2醫(yī)用離心機 北京新時代北利醫(yī)療器械有限公司；Mini系列桌面型離心機 生工生物工程（上海）股份有限公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ROB15 HEAL FOECE超純水系統(tǒng) 上海康雷分析儀器有限公司；DMEX20系列生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司；DDSJ-308A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種制備

菌種活化：從-80 ℃斜面保存的禾谷鐮刀菌菌種中，挑取一小塊菌絲，接種于PDA平板，25 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3 d，菌落邊緣切取菌絲塊，接種于PDA平板，同樣條件下活化3 d。

孢子儲備液制備：取7 mm新鮮菌餅，接種到綠豆瓊脂培養(yǎng)基平板，25 ℃、12 h紫外/12 h黑暗環(huán)境下培養(yǎng)4～8 d后，每個平板用5 mL滅菌超純水洗脫，經(jīng)過2 層拭鏡紙過濾后，血球計數(shù)板計數(shù)。將洗脫下的孢子液以體積比1∶100添加到滅菌后的羧甲基纖維素培養(yǎng)基中，25 ℃、175 r/min見光培養(yǎng)3 d，抽濾。得到的孢子液在4 ℃、8 600 r/min下離心10 min，下層沉淀為孢子儲備液。

菌絲富集：用10 mL滅菌超純水將菌絲從PDA平板洗脫，所得的菌絲溶液以體積比1∶100添加到滅菌后的酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)液中，25 ℃、175 r/min見光培養(yǎng)3 d。抽濾除去廢液，所得菌絲體用無菌純水洗滌3 次。

1.3.2 丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌的抑制能力測定

丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于無水乙醇得到0.006、0.012、0.018、0.024、0.036 mol/L的丁香酚溶液、0.007、0.013、0.019、0.026、0.039 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。采用平板涂布法將400 μL不同活性成分溶液涂抹在PDA平板表面，接種新鮮菌餅（直徑5 mm），25 ℃避光環(huán)境下培養(yǎng)3 d，測量菌絲直徑。以不含植物精油活性成分的無水乙醇為對照組。參照Wan Jing等[14-15]的方法計算百里香酚、丁香酚和香芹酚抑制菌絲生長的半數(shù)有效作用濃度（50% effective concentration，EC50）。

1.3.3 丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制能力測定

將丁香酚、香芹酚和百里香酚溶于無水乙醇得到0.030、0.059、0.089、0.119、0.149、0.239 mol/L的丁香酚溶液、0.032、0.065、0.097、0.130、0.162、0.261 mol/L的香芹酚溶液和百里香酚溶液。500 μL溶液與孢子液（1×105個/mL）等體積混合后，取40 μL混合液涂抹在瓊脂平板表面，25 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 h后，生物顯微鏡下計數(shù)。對照組使用500 μL孢子液與無水乙醇等體積混合。參照Wan Jing等[15]的方法計算丁香酚、香芹酚和百里香酚抑制孢子萌發(fā)的EC50。

1.3.4 丁香酚、香芹酚和百里香酚對DON毒素生物合成抑制測定

禾谷鐮刀菌的孢子液（1×107個/mL）按體積比1∶1與濃度為EC50和10×EC50的不同活性成分溶液混合。接種到已滅菌的大米培養(yǎng)基上，25 ℃避光條件下培養(yǎng)30 d，每天定時搖勻培養(yǎng)基[14-15]。對照組使用孢子液與無水乙醇等體積混合。大米培養(yǎng)基經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，按照DON殘留酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中DON含量。

1.3.5 丁香酚、香芹酚和百里香酚對菌絲電導(dǎo)率的影響

參考Duan Yabing等[16]的方法并作適當(dāng)修改，將1 g菌絲體重懸于10 mL不同濃度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，用電導(dǎo)率儀測定0 h菌絲溶液的電導(dǎo)率，2.5 h后將菌絲體煮沸5 min，測定最終電導(dǎo)率。2.5 h電導(dǎo)率差值計算公式如下。

1.3.6 丁香酚、香芹酚和百里香酚對菌絲體中MDA和ATP含量的影響

稱取1 g菌絲體重懸于10 mL不同濃度（EC50、10×EC50、100×EC50）的活性成分溶液中，混勻5 s，25 ℃黑暗環(huán)境培養(yǎng)12 h，無菌超純水洗滌3 次，加入體積分?jǐn)?shù)0.9%無菌生理鹽水進行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min取上清液。對照組使用孢子液與無水乙醇等體積混合。按照微量MDA檢測試劑盒說明書，每個樣品取100 μL檢測其MDA含量；按照ATP含量檢測試劑盒說明書，每個樣品取30 μL檢測其ATP含量。

1.3.7 轉(zhuǎn)錄組測序分析

菌絲處理方式參考1.3.6節(jié)。洗滌后的菌絲用3 mL離心管凍存，委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行RNA提取和RNA-Seq測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾獲得Clean Reads。采用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM）（即每百萬Reads的每kb外顯子片段）方法計算和歸一化EC50丁香酚乙醇溶液處理的Eug01組、EC50香芹酚乙醇溶液處理的Car01組、EC50百里香酚乙醇溶液處理的Thy01組以及生理鹽水處理的NS組的基因表達(dá)水平。以錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.01和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于4作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。使用ClusterProfile軟件進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗均重復(fù)3 次，實驗結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫并作圖，采用SPSS 2.0軟件對結(jié)果進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種活性成分溶液對菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)有抑制作用且呈劑量依賴性。隨著活性成分濃度的升高，菌落直徑明顯縮小，生長趨勢減弱，孢子存活概率小，喪失繁殖能力。用抑制50%菌絲生長或孢子萌發(fā)的EC50衡量3種苯酚類活性成分對禾谷鐮刀菌菌絲生長的抗菌活性，由表1可知，百里香酚和香芹酚對禾谷鐮刀菌的菌絲生長的抑制效果優(yōu)于丁香酚；百里香酚對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制效果最好，丁香酚和香芹酚次之。

表1 丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制作用的EC50Table 1 EC50 of eugenol, carvacrol, and thymol against the mycelium growth and spore germination of F. graminearum

2.2 3種活性成分溶液對DON合成的影響

DON是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌及其他產(chǎn)毒的鐮刀菌木霉菌等產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，作為一種常見的單端孢霉烯族毒素，DON在谷物食品中檢出率和超標(biāo)率較高。DON含量的減少能夠降低谷類及其相關(guān)制品的安全風(fēng)險。由圖1可知，與對照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均能顯著降低DON的合成（P＜0.05）。10×EC50百里香酚溶液相對于EC50百里香酚溶液處理后，20 g大米培養(yǎng)基中DON含量由96.848 μg/L降低到81.465 μg/L。相對于EC50，10×EC50丁香酚和香芹酚處理后，DON含量分別降低了21.304 μg/L和4.384 μg/L。在EC50水平下百里香酚抑制DON生成的效果顯著優(yōu)于丁香酚和香芹酚，在10×EC50處理濃度下百里香酚和丁香酚的抑制效果顯著優(yōu)于香芹酚，說明百里香酚和丁香酚抑制DON生成的效果較好。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，百里香酚能同時引起DON生物合成相關(guān)基因TRI5和TRI6的下調(diào)，而丁香酚和香芹酚只分別作用于TRI6和TRI5。綜上所述，百里香酚對禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON的抑制效果優(yōu)于香芹酚和丁香酚處理。

圖1 丁香酚、香芹酚和百里香酚對DON合成的影響Fig. 1 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol against the biosynthesis of deoxynivalenol by F. graminearum

2.3 3種活性成分溶液對電解質(zhì)泄漏的影響

細(xì)胞膜是微生物屏障，既可以阻擋外源物質(zhì)進入，也可以防止內(nèi)部物質(zhì)流出。若細(xì)胞膜遭受損壞，流動性被抑制，膜滲透性改變，胞內(nèi)電解質(zhì)發(fā)生外漏，最終會影響菌體生長[17]。采用電導(dǎo)率法驗證了在丁香酚、香芹酚和百里香酚作用下禾谷鐮刀菌菌絲體膜通透性的變化（表2）。與對照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚均引起禾谷鐮刀菌電導(dǎo)率值增加，且隨著處理液濃度的增大，菌絲體溶液的電導(dǎo)率值呈上升趨勢，說明丁香酚、香芹酚和百里香酚引發(fā)細(xì)胞膜損傷。100×EC50作用下，香芹酚對細(xì)胞膜的損傷程度明顯超過丁香酚和百里香酚。百里香酚及其納米乳處理禾谷鐮刀菌后，掃描電子顯微鏡下均能觀察到菌絲體出現(xiàn)不規(guī)則收縮，細(xì)胞內(nèi)膜的完整性和通透性被破壞[8,18]。

2.4 3種活性成分溶液對菌絲體中MDA和ATP含量的影響

植物精油可能引起禾谷鐮刀菌細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化改變膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，產(chǎn)生MDA副產(chǎn)物。由表2可知，各處理組MDA濃度與對照組相比均增加，隨著處理液濃度的升高，菌絲體溶液的MDA濃度增加，說明禾谷鐮刀菌受到刺激后，細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化程度增加。與之結(jié)果相似，Kalagatur等[19]發(fā)現(xiàn)魯沙香茅精油處理后的小麥赤霉病菌細(xì)胞中MDA含量增加。MDA可進一步與DNA發(fā)生反應(yīng)，與2’-脫氧鳥苷產(chǎn)生丙烷加合物，對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、增殖、分化和凋亡等生理功能產(chǎn)生不利影響。

表2 丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌菌絲體電導(dǎo)率、ATP、MDA濃度的影響Table 2 Effects of eugenol, carvacrol, and thymol on the conductivity, ATP content, and MDA level of mycelium solution

ATP作為能量轉(zhuǎn)換載體，其水平的改變會影響細(xì)胞功能。由表2可知，各處理組禾谷鐮刀菌菌絲溶液中ATP濃度均低于對照組，且隨著處理濃度的增加，ATP含量不斷下降；與EC50相比，10×EC50香芹酚處理禾谷鐮刀菌后，菌絲溶液中ATP含量由0.090 mmol/L降為0.046 mmol/L，但無顯著差異（P＞0.05）；表明經(jīng)過處理的禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)能不足。通常，ATP含量降低預(yù)示線粒體功能受損，細(xì)胞處于凋亡、壞死或毒性狀態(tài)下。丁香酚還能夠引發(fā)婁地青霉和黑曲霉線粒體形態(tài)損傷和功能受損[20]。

2.5 基因差異表達(dá)分析

從圖2看出，丁香酚對禾谷鐮刀菌的影響最大，顯著差異基因數(shù)最多（225個），上調(diào)差異基因19個，下調(diào)差異基因206個。與對照組相比，香芹酚處理禾谷鐮刀菌后得到139個差異基因，其中30個基因表達(dá)上調(diào)，109個基因表達(dá)下調(diào)。百里香酚溶液處理后，得到135個差異基因，上調(diào)基因（10個）占7.41%。此外，禾谷鐮刀菌經(jīng)處理后表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)高于上調(diào)基因，這些基因的表達(dá)可能受到丁香酚、香芹酚和百里香酚明顯的干預(yù)。高弢等[21]利用麝香草酚處理禾谷鐮孢菌后進行轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)了類似趨勢。這說明菌株可以通過調(diào)整部分基因的表達(dá)應(yīng)對不同苯酚類植物精油活性成分的刺激。

圖2 禾谷鐮刀菌響應(yīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析Fig. 2 Transcriptomic analysis of F. graminearum treated with eugenol,carvonol or thymol

2.6 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果

差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果表明（圖3），與對照組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后所得差異基因在生物學(xué)過程的核糖體生物發(fā)生、核糖核蛋白復(fù)合物生物發(fā)生、rRNA加工、rRNA代謝過程、ncRNA加工、細(xì)胞成分生物發(fā)生；細(xì)胞組分的氧化還原酶復(fù)合物、質(zhì)子轉(zhuǎn)運ATP合酶復(fù)合物、耦合因子F(o)的質(zhì)子轉(zhuǎn)運ATP合酶復(fù)合物、質(zhì)子轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的質(zhì)子轉(zhuǎn)運雙區(qū)ATP酶復(fù)合物和分子功能的血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、分子內(nèi)氧化還原酶活性等12 條GO term均存在富集。

圖3 禾谷鐮刀菌響應(yīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚刺激下的GO功能富集前30個通路Fig. 3 Top 30 GO enriched pathways of F. graminearum treated with eugenol, carvonol or thymol

丁香酚、香芹酚和百里香酚破壞核糖體和線粒體結(jié)構(gòu)，影響禾谷鐮刀菌的能量和物質(zhì)代謝。這也驗證了禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低是由于丁香酚、香芹酚和百里香酚破壞了禾谷鐮刀菌線粒體的結(jié)構(gòu)，造成能量供應(yīng)不足。此外，GO富集結(jié)果顯示丁香酚借助甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控基因表達(dá)和生理過程中間產(chǎn)物的合成與降解反應(yīng)。香芹酚改變了禾谷鐮刀菌膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，這可能是由于脂質(zhì)過氧化的存在。禾谷鐮刀菌通過調(diào)整微管蛋白和肌動蛋白細(xì)胞骨架響應(yīng)里香酚的刺激。

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析結(jié)果

通過KEGG數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)分析差異表達(dá)基因在禾谷鐮刀菌中的代謝途徑和功能。結(jié)果表明，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理的禾谷鐮刀菌差異基因被共同注釋到18 條通路（表3）。此外，丁香酚處理（Eug01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還被注釋到氮代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醚脂質(zhì)代謝、抗壞血酸和醛糖代謝、肌醇磷酸代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸互變、酪氨酸代謝等。香芹酚處理（Car01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還注釋到氮代謝、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、精氨酸和脯氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)（三羧酸循環(huán)）、核苷酸切除修復(fù)、乙醛酸鹽和二羧酸鹽和碳代謝。百里香酚處理（Thy01組）的禾谷鐮刀菌差異基因還被注釋到RNA降解和酪氨酸代謝。

表3 DON生物合成中心基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 3 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

RNA翻譯到蛋白質(zhì)發(fā)生在核糖體。真核生物的80S核糖體定位于其胞質(zhì)，由核糖體RNA及核糖體蛋白質(zhì)組成。核糖體的大小亞基相互配合共同在蛋白質(zhì)合成過程中將mRNA轉(zhuǎn)化為多肽鏈。香芹酚處理后，下調(diào)基因富集到真核生物中的核糖體生物發(fā)生，大多數(shù)核糖體基因與翻譯功能、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生有關(guān)，這表明核糖體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，轉(zhuǎn)錄過程受到影響，蛋白質(zhì)合成受到抑制。

氧化磷酸化由電子傳遞鏈和磷酸化兩部分構(gòu)成，電子通過電子傳遞鏈產(chǎn)生跨膜的質(zhì)子梯度即質(zhì)子動勢，用于驅(qū)動ATP合酶合成ATP，為DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等生理過程提供能量[22]。禾谷鐮刀菌經(jīng)丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，差異基因在氧化磷酸化途徑存在顯著富集，說明參與氧化磷酸化的線粒體復(fù)合物I、復(fù)合物II、復(fù)合物III、復(fù)合物IV和復(fù)合物V受到嚴(yán)重影響，能量合成被抑制，ATP含量降低。線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞中的活性氧迅速增加，氧化還原酶和過氧化氫酶活力被降低，活性氧水平超過防御機制，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，MDA含量增加，細(xì)胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，菌絲體溶液電導(dǎo)率增加。檸檬醛通過積累大量活性氧破壞氧化磷酸化途徑和細(xì)胞膜的完整性，抑制洋青霉菌生長[23]。氧化應(yīng)激還會引起蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷、酶抑制，甚至造成細(xì)胞程序性死亡。

微生物受到不良刺激后，激活自我保護系統(tǒng)，改變細(xì)胞膜脂肪酸組分來保持其流動性。脂肪酸合成與代謝通路相關(guān)的差異基因表達(dá)下調(diào)，說明丁香酚、香芹酚和百里香酚可能抑制了禾谷鐮刀菌自我保護能力。百里香酚具有擾亂細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的能力，可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的增加。

核苷酸切除修復(fù)是最普遍的DNA修復(fù)機制，識別和處理活細(xì)胞中多種類型的DNA損傷[12]。禾谷鐮刀菌菌絲調(diào)控DNA修復(fù)機制應(yīng)對丁香酚引起的DNA損傷。單萜橙花醇引起了甘薯黑斑病菌核染色質(zhì)的濃縮和伴隨的DNA裂解，導(dǎo)致DNA修復(fù)基因表達(dá)上調(diào)，丁香酚也破壞和降解婁地青霉和黑曲霉的DNA[24-25]。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白在禾谷鐮刀菌的抗藥性和發(fā)病機制中發(fā)揮著重要而多樣的作用[26-27]。丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，差異基因富集到ABC轉(zhuǎn)運蛋白，說明物質(zhì)的主動運輸過程發(fā)生改變，重金屬解毒、脂質(zhì)代謝、信號傳導(dǎo)、多藥抗性、核糖體生物合成和mRNA轉(zhuǎn)運等多種生命活動均受到影響[28]。

從上述結(jié)果來看，丁香酚、香芹酚和百里香酚有可能通過影響禾谷鐮刀菌核糖體結(jié)構(gòu)和功能，造成氧化磷酸化途徑相關(guān)酶活的改變，導(dǎo)致線粒體功能障礙，ATP合成減少，氧化應(yīng)激狀態(tài)被激活，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜損傷。同時，禾谷鐮刀菌自我保護能力被抑制，加劇了細(xì)胞損傷程度，耐藥性下降。

2.8 參與DON生物合成途徑的基因表達(dá)分析結(jié)果

DON的生物合成包含一系列的酶促反應(yīng)，約有12～16個相關(guān)基因參與調(diào)控。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用后，禾谷鐮孢菌中參與DON生物合成的TRI基因轉(zhuǎn)錄水平變化如表4所示。在本研究中，與NS組相比，丁香酚、香芹酚和百里香酚處理后，編碼C7、C8或C7,8加氧酶的TRI1基因、編碼轉(zhuǎn)錄蛋白的TRI10基因、編碼C15羥化酶的TRI11基因、編碼C3乙?；傅腡RI101基因出現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)，編碼單端孢霉烯3-O-酯酶的TRI8基因和編碼毒素外排泵的TRI12基因上調(diào)表達(dá)。百里香酚引起DON生物合成通路關(guān)鍵基因TRI5和TRI6基因下調(diào)表達(dá)，TRI5基因是DON生物合成第一步的關(guān)鍵基因[29]，其編碼的單端孢霉二烯酶催化法尼基焦磷酸骨架結(jié)構(gòu)環(huán)化形成母核結(jié)構(gòu)單端孢二烯[30]。TRI6是單端孢霉烯合成的正調(diào)控因子，禾谷鐮刀菌中TRI6基因缺失后DON和T-2毒素合成能力完全喪失，且多個參與DON毒素合成的TRI表達(dá)量也明顯下調(diào)[31-33]。體外產(chǎn)毒實驗結(jié)果證實百里香酚對禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON的抑制效果最優(yōu)。

表4 DON生物合成中心基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 4 Transcriptional levels of the central genes of DON biosynthesis

2.9 MAPK信號通路相關(guān)的基因表達(dá)分析結(jié)果

DON的生物合成除受TRI基因調(diào)控以外，還受到MAPK信號通路的調(diào)控。禾谷鐮刀菌MAPK通路包含3個磷酸化途徑：參與調(diào)控細(xì)胞壁完整性的Mgv1、參與信息素信號途徑的Gpmk1、參與高滲透性甘油信號途徑的FgHog1[34-35]。丁香酚、香芹酚和百里香酚均上調(diào)了Gpmk1磷酸化途徑的FgSte11、FgSte7基因，下調(diào)了Mgv1磷酸化途徑的FgMgv1基因和FgHog1磷酸化途徑的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因（表5）。FgMgv1中心激酶基因缺失后，DON毒素的生物合成能力基本喪失，細(xì)胞壁嚴(yán)重缺損，菌落生長緩慢[36]。破壞禾谷鐮刀菌Gpmk1磷酸化途徑導(dǎo)致菌絲生長緩慢，分生孢子產(chǎn)率和DON產(chǎn)量下降[37]。FgHog1磷酸化途徑的FgPBS2、FgSSK2中心激酶基因同樣參與了菌絲生長、有性生殖、毒素合成和植物侵染等過程[38]。

表5 MAPK信號通路中心激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Table 5 Transcription levels of central kinase genes in MAPK signaling pathway

3 結(jié) 論

通過體外抑菌實驗表明丁香酚、香芹酚和百里香酚對禾谷鐮刀菌菌絲生長抑制的EC50為0.015、0.006 mol/L和0.005 mol/L，對孢子萌發(fā)抑制的EC50為0.116、0.130 mol/L和0.076 mol/L。丁香酚、香芹酚和百里香酚作用于禾谷鐮刀菌核糖體和線粒體，抑制酶的生成，氧化磷酸化途徑失調(diào)，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，電解質(zhì)滲漏，能量代謝失衡。百里香酚下調(diào)了DON生物合成途徑中關(guān)鍵基因TRI5和TRI6的表達(dá)，達(dá)到最優(yōu)抑制效果。丁香酚、香芹酚和百里香酚通過Mgv1磷酸化信號通路調(diào)節(jié)DON毒素合成。本研究從分子水平闡釋了丁香酚、香芹酚和百里香酚3種精油活性成分對禾谷鐮刀菌的抑制機制，對精油活性成分用于食品工業(yè)采后真菌和真菌毒素控制具有參考價值。RNA-Seq測序發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的禾谷鐮刀菌有關(guān)自身修復(fù)的基因下調(diào)，自我保護能力被抑制，可能會加劇細(xì)胞損傷程度，造成耐藥性下降，后續(xù)工作可圍繞這一點展開研究。