李國(guó)梁,周曉倩,唐煥峰,王 瑋,陳克正

(青島科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266042)

隨著抗生素的濫用,引起了細(xì)菌多重耐藥性,大大削弱了傳統(tǒng)抗生素的治療效果。據(jù)統(tǒng)計(jì),大多數(shù)致死性細(xì)菌感染是由耐藥菌引起的[1]。研究發(fā)現(xiàn),與耐藥菌有關(guān)的感染通常表現(xiàn)出對(duì)抗生素有較強(qiáng)的抵抗力和不敏感性。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜作為細(xì)菌的屏障,可保護(hù)細(xì)菌免受各種抗菌劑的侵害,有證據(jù)表明,抗菌劑吸收的增加可提高抗菌效率[2]?？焖倌ご┩傅牟牧媳憧梢钥缭竭@道保護(hù)屏障,穿透細(xì)胞壁、細(xì)胞膜,直接進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部,破壞膜的調(diào)節(jié)功能,進(jìn)而使蛋白質(zhì)和DNA/RNA分子失活[3-4]。到目前為止,已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了幾種抗菌劑[5],基于帶正電的試劑和帶負(fù)電的膜之間的靜電吸引,采用陽(yáng)離子策略通過(guò)細(xì)菌策略轉(zhuǎn)移到細(xì)菌的細(xì)胞膜上。但是,陽(yáng)離子化合物會(huì)引起哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的破壞,較高的細(xì)胞毒性限制了其應(yīng)用。生物相容性好、能夠穿透膜結(jié)構(gòu)的材料便可解決該問(wèn)題,并且目前有關(guān)材料能夠穿膜進(jìn)行抗菌的報(bào)道比較少見(jiàn)。

光熱抗菌劑(PTA)被認(rèn)為是最潛在的抗菌策略之一。許多文獻(xiàn)已經(jīng)證明,從光能轉(zhuǎn)換而來(lái)的熱量可以抑制多藥耐藥細(xì)菌的生長(zhǎng)[6]。更重要的,近紅外光具有高組織滲透性以及可忽略不計(jì)的熱損傷等特點(diǎn)[7]。聚噻吩(PEDOT)是一種眾所周知的聚合物光熱材料,具有良好的生物相容性和可降解性,因此在臨床上具有更好的應(yīng)用前景。目前報(bào)道的聚合物基光熱材料大多是非水溶性的納米顆粒,在用于體內(nèi)治療之前需要進(jìn)行復(fù)雜的表面修飾,使材料的光熱性能、生物相容性受到限制。制備水溶性聚合物雖然采用天然的氧化還原酶做催化劑可以解決這一問(wèn)題,但天然酶易變性、不穩(wěn)定等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了這一制備工藝的發(fā)展。而磷酸銅納米酶(CuPOs)具有高催化活性,且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,耐酸耐堿、穩(wěn)定性好,克服了傳統(tǒng)模擬酶合成復(fù)雜、提純困難和對(duì)環(huán)境敏感的問(wèn)題。

本研究從開(kāi)發(fā)快速、高效、副作用最小的抗菌方案的角度出發(fā),報(bào)道了一種對(duì)于生物系統(tǒng)相容性至關(guān)重要的酶模擬水合成方法,以磷酸銅(CuPOs)納米酶為催化劑,3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethoxylene dioxy thiophene,EDOT)為單體,聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)為模板,雙氧水為引發(fā)劑,評(píng)價(jià)了水溶性PEDOT:PSS的綠色合成及其抗菌應(yīng)用研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene,EDOT),聚苯乙烯磺酸鈉(poly(p-styrenesulfonic acid),PSS),尿素(H2NCONH2),乙醇,二甲苯,硫酸銅(CuSO4·5H2O),磷酸(H3PO4),磷酸氫二鈉十二水合物(Na2HPO4·12 H2O),檸檬酸一水合物(C6H8O7·H2O),H2O2(30%)等購(gòu)自西格瑪實(shí)試劑公司;二甲基亞砜(DMSO),瓊脂,酵母提取物,胰蛋白胨等購(gòu)自Bodi Chemical Co.,Ltd(中國(guó)天津)。

高壓反應(yīng)釜,170 m L,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;恒溫箱,SX2-X-16系列,濟(jì)南精密科學(xué)儀器有限公司;高速離心機(jī)(TG/16G),天津市奧特賽恩斯儀器廠;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(FLASH),美國(guó)賽默飛世爾科技公司;紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)(UV-Vis-NIR),TU-1810型,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;共聚焦熒光顯微鏡(CLSM),ECLIPSE Ti2-E型,日本Nikon公司;熒光分光光度計(jì),F4600型,日本Hitachi公司;近紅外熱成像相機(jī),Ti200型,美國(guó)Fluke公司。

1.2 水溶性PEDOT:PSS的合成

1.2.1 CuPOs納米酶的制備

取尿素(H2NCONH2)6.000 g,置于250 m L燒杯中,加入84 m L超純水?dāng)嚢柚寥芙?稱取0.050 g十二烷基硫酸鈉(SDS)于溶液中,攪拌10 min;取0.125 g五水合硫酸銅(CuSO4·5 H2O)溶于8 m L超純水?dāng)嚢?0 min后;0.049 g磷酸(20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H3PO4)溶于8 m L超純水加入其中攪拌1 h;將溶液迅速移至150 m L高壓反應(yīng)釜;80℃恒溫反應(yīng)2 h;室溫冷卻1 h,將產(chǎn)物離心,先用超純水、后用無(wú)水乙醇分別洗滌3遍;將沉淀物60℃干燥24 h,得到最終產(chǎn)物CuPOs納米酶。

1.2.2 水溶性PEDOT:PSS的制備

取檸檬酸(19.2 m L,0.1 mol·L－1)與磷酸氫二鈉(0.8 m L,0.2 mol·L－1)的緩沖液(p H＝2.2)于50 m L燒杯,加入124.0 mg的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)攪 拌30 min;加 入87.0 mg噻 吩 單 體(EDOT)攪拌1 h;加入5.0 mg Cu POs納米酶,將612μL雙氧水(1.0 mol·L－1)逐滴滴加于上述溶液中;60℃恒溫水浴24 h,產(chǎn)品經(jīng)透析膜(cutoff KDa為8 000～14 000)透析48 h;將透析完成的產(chǎn)物置于溫度為60℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干,得到水溶性PEDOT:PSS。

1.3 水溶性PEDOT:PSS的性能表征

1.3.1 熒光表征

在室溫下,配制0.5 mg·m L－1PEDOT:PSS水溶液,使用熒光分光光度計(jì),通過(guò)808 nm二極管激光器作為激發(fā)源,進(jìn)行熒光性能測(cè)量。

近日，從全國(guó)工商聯(lián)組織工作會(huì)議上傳來(lái)消息，云南省昆明市官渡區(qū)工商聯(lián)連續(xù)第二次被評(píng)為全國(guó)“五好”縣級(jí)工商聯(lián)。全國(guó)“五好”縣級(jí)工商聯(lián)是官渡區(qū)圍繞“領(lǐng)導(dǎo)班子好、會(huì)員發(fā)展好、商會(huì)建設(shè)好、作用發(fā)揮好、工作保障好”等五個(gè)方面努力得到的成果，尤其是多措并舉為會(huì)員企業(yè)破解融資難題獲得一致贊譽(yù)。

1.3.2 光熱升溫性能表征

1)將不同濃度的材料水溶液(500μL,0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·mL－1)加入1.5 mL EP管中,進(jìn)行近紅外激光照射(808 nm,1.5 W·cm－2,5 min)。每隔20 s,用近紅外熱成像相機(jī)記錄溶液的溫度,并將升溫?cái)?shù)據(jù)繪制成升溫曲線。

2)將不同濃度的材料水溶液(500μL,0、0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)加入1.5 m L EP管中,分別進(jìn)行不同功率密度的近紅外激光照射(808 nm,0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2,5 min)。用近紅外熱成像相機(jī)記錄溶液被照射5 min后的最終溫度。

1.3.3 光熱循環(huán)穩(wěn)定性及光熱轉(zhuǎn)換效率評(píng)價(jià)

取0.4 m L H2O于1.5 m L EP管 中,稱 量H2O的 凈 重,用 近 紅 外 激 光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射5 min后,在正常條件下冷卻至室溫。在此期間,每20 s記錄一次EP管的實(shí)時(shí)溫度。然后在相同實(shí)驗(yàn)條件下,用近紅外激光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射材料水溶液(0.4 m L,2.0 mg·m L－1),重復(fù)5次,每次都需對(duì)溶液凈重進(jìn)行測(cè)量,最后根據(jù)升溫降溫?cái)?shù)據(jù)繪制時(shí)間-溫度曲線。

最后,根據(jù)繪制的時(shí)間-溫度曲線,并通過(guò)公式計(jì)算材料的光熱轉(zhuǎn)換效率[8]:

其中,η是材料的光熱轉(zhuǎn)換效率,Tmax是溶液通過(guò)升溫所能達(dá)到的最高溫度,Tsurr是溶液實(shí)驗(yàn)過(guò)程的環(huán)境溫度,A808是材料水溶液在808 nm處的吸光度,Qdis是溶液在升溫過(guò)程中與環(huán)境熱交換消耗的熱量,C是水的比熱容,m是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溶液的凈重,T是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溶液的實(shí)時(shí)溫度,τs為材料溶液降溫曲線擬合直線的斜率,I為近紅外激光器的功率密度。

收集Wistar大鼠動(dòng)脈血(來(lái)自心臟或腹主動(dòng)脈的血液),并加入肝素抗凝。將抗凝血3 000 r·min－1、4℃環(huán)境下離心5 min后獲得紅細(xì)胞,用PBS洗滌3次后,配制一定體積5%紅細(xì)胞懸液待用。制備500μL不同濃度(0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)的樣品溶液,以PBS作為陰性對(duì)照,以1% Triton X100作為陽(yáng)性對(duì)照,分別與500μL 5%紅細(xì)胞懸液混勻。將混合物在37℃下孵育3～4 h,離心分離并留存照片,并測(cè)定上清液在540、570 nm的OD值。參考以下公式計(jì)算溶血率x(由于樣品在540、570 nm處有吸收,故設(shè)置對(duì)應(yīng)空白材料組以除去材料吸收對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響):

1.4 水溶性PEDOT:PSS的抗菌性能評(píng)價(jià)

細(xì)菌選用革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要細(xì)菌操作間和潔凈臺(tái)及主要器械耗材的消毒。

1.4.1 熒光共定位

孵育細(xì)菌MRSA過(guò)夜;次日,將搖好的菌液用PBS洗滌后,利用LB培養(yǎng)基將細(xì)菌懸液濃縮至4×109CFU·m L－1(OD600＝4),與PEDOT:PSS(0.2 mg·m L－1)共孵育30 min;PBS離心洗滌3次去除殘留的PEDOT:PSS,用DAPI溶液(1.0 m L,10 μg·m L－1)室溫重懸5 min;最后用PBS洗滌2次,進(jìn)行共聚焦成像。

1.4.2 平板計(jì)數(shù)

1)將制備的濃度為109CFU·m L－1(OD600＝1)的細(xì)菌懸液隨機(jī)分為4組:“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”;

2)依次加入125μL PBS、125μL PBS、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1)、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1),然后加入菌液至500μL,依次命名為“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”,搖床搖幌30 min,將“NIRonly”“PEDOT:PSS＋NIR”組取出進(jìn)行近紅外激光照射(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)后孵育2 h。

3)細(xì)菌涂板:將共孵育菌液用PBS稀釋10萬(wàn)倍(10×10×20×50稀釋),取100μL稀釋后的菌液于培養(yǎng)皿中心位置,并用滅菌三角形涂板棒將菌液涂抹均勻(設(shè)置3組平行試驗(yàn))。最后做好標(biāo)記將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫孵箱靜置培養(yǎng)。

4)菌落計(jì)數(shù):待固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單克隆菌落后,使用化學(xué)發(fā)光成像儀對(duì)菌落記錄,并對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的單克隆菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 水溶性PEDOT:PSS紅外光譜分析

PEDOT:PSS的合成示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 PEDOT:PSS的合成示意圖Fig.1 Schematic diagram of the synthesis of PEDOT:PSS

如圖2(a)所示,產(chǎn)物在CuPOs納米酶的催化條件下成功合成,并在808 nm處有強(qiáng)吸收。另外,由圖2(b)可知,產(chǎn)物在3 442 cm－1處有非常強(qiáng)的吸收峰,是由產(chǎn)物的水分中的－OH伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的;在2 925 cm－1處的吸收峰為EDOT中CH2的伸縮振動(dòng)造成的;1 604 cm－1處的吸收峰為苯環(huán)中的骨架振動(dòng)引起的;1 185、1 129 cm－1處的吸收峰為EDOT中C－O鍵的伸縮振動(dòng)造成的;1 041、1 009和939 cm－1處的吸收峰是C－O－C鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng);775、673和518 cm－1處的吸收峰為C－S鍵的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致。綜上,證明了水溶性聚合物PEDOT:PSS的成功合成。

圖2 有無(wú)CuPOs納米酶催化條件下產(chǎn)物的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收和PEDOT:PSS的紅外譜圖Fig.2 UV-Vis-NIR absorption of the product with or without CuPOs nanoenzyme catalysis and the infrared spectrum of PEDOT:PSS

2.2 水溶性PEDOT:PSS光熱升溫性能評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所合成的水溶性PEDOT:PSS的光熱性能,評(píng)價(jià)了不同濃度的PEDOT:PSS溶液(0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)在近紅外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后的升溫情況,結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3(a)可以看出,PBS溶液經(jīng)過(guò)5 min照射后,溫度始終維持在25.9℃;當(dāng)PEDOT:PSS濃度為0.05 mg·m L－1時(shí),最高溫度就可達(dá)51.4℃,具有良好的光熱升溫效果,可對(duì)材料能否應(yīng)用于光熱抗菌領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步研究;當(dāng)PEDOT:PSS濃度為0.50 mg·mL－1時(shí),升溫高達(dá)82℃;然而當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí),發(fā)現(xiàn)溫度的上升受到限制,猜測(cè)其原因可能是溶液與環(huán)境強(qiáng)烈的熱交換限制了其溫度的進(jìn)一步升高。另外又對(duì)不同濃度(0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)的PEDOT:PSS進(jìn)行了在不同功率密度(0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2)照射5 min后的升溫情況評(píng)價(jià),如圖3(b)所示,進(jìn)一步說(shuō)明了水溶性PEDOT:PSS優(yōu)異的光熱升溫效果,后續(xù)抗菌實(shí)驗(yàn)選用濃度為0.2 mg·m L－1的PEDOT:PSS水溶液,照射參數(shù)為808 nm,1.50 W·cm－2,5 min。

圖3 不同濃度PEDOT:PSS在不同條件下的升溫曲線及最終溫度Fig.3 Heating curve and final temperature of different concentrations of PEDOT:PSS under different conditions

2.3 水溶性PEDOT:PSS光熱循環(huán)穩(wěn)定性及光熱轉(zhuǎn)換效率評(píng)價(jià)

光熱材料不僅僅需要具有良好的光熱升溫效果,還需要具有良好的光熱循環(huán)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)換效率等,才能更有利于應(yīng)用于光熱抗菌領(lǐng)域。因此,本研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)了PEDOT:PSS的光熱循環(huán)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)換效率,結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)濃度為2.00 mg·m L－1的水溶性PEDOT:PSS的水溶液進(jìn)行了5次升溫循環(huán),近紅外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后均能達(dá)到80℃左右,具有良好的光熱循環(huán)穩(wěn)定性。同時(shí),經(jīng)過(guò)計(jì)算,PEDOT:PSS的光熱轉(zhuǎn)換效率高達(dá)46.4%,具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效率。

圖4 PEDOT:PSS的升溫循環(huán)曲線及光熱轉(zhuǎn)換效率Fig.4 Heating cycle curves and photothermal conversion efficiency of PEDOT:PSS

2.4 水溶性PEDOT:PSS生物相容性評(píng)價(jià)

水溶性PEDOT:PSS對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)始終是異物,可能會(huì)產(chǎn)生一些排異反應(yīng),因此,其生物相容性評(píng)價(jià)至關(guān)重要,溶血率低于3%被認(rèn)為是不溶血的、生物相容性好的[9]。圖5為不同濃度下PEDOT:PSS的溶血率。即使PEDOT:PSS的濃度為1.00 mg·m L－1時(shí),溶血率僅為4.59%±0.14%,可以認(rèn)為溶血率很低,而劑量在0.50 mg·m L－1時(shí),溶血率僅為1.83%±0.13%,表明了合成的水溶性PEDOT:PSS具有良好的生物安全性。

圖5 不同濃度下PEDOT:PSS的溶血率Fig.5 Hemolysis rate of PEDOT:PSS under gradient concentration

2.5 水溶性PEDOT:PSS光熱抗菌評(píng)價(jià)

將MRSA與水溶性PEDOT:PSS溶液共孵育5、30、120 min后的熒光共定位,如圖6所示。紅色熒光代表細(xì)菌,綠色熒光代表PEDOT:PSS,發(fā)現(xiàn)共孵育5 min時(shí),PEDOT:PSS所發(fā)出的綠色熒光已被紅色熒光所包含,證明了PEDOT:PSS能夠在5 min時(shí)很快地進(jìn)去細(xì)菌內(nèi)部,證明合成的水溶性PEDOT:PSS優(yōu)異的穿膜性質(zhì)。由于蛋白質(zhì)在高于60～70℃環(huán)境下就會(huì)變質(zhì)[7],而PEDOT:PSS光熱升溫能達(dá)到78.467℃,材料穿膜后再結(jié)合激光照射,所產(chǎn)生的熱量將會(huì)直接在細(xì)菌內(nèi)部對(duì)生命活性分子如蛋白質(zhì)等造成十分嚴(yán)重的不可逆熱損傷,從而大大提升PEDOT:PSS的光熱抗菌效率。

圖6 DAPI染色的MRSA與PEDOT:PSS共孵育5、30和120 min的CLSM圖像Fig.6 CLSM images of DAPI-stained MRSA co-incubated with PEDOT:PSS for 5,30 and 120 min

對(duì)于水溶性PEDOT:PSS的抗菌評(píng)價(jià),采用了平板計(jì)數(shù)法研究其對(duì)MRSA、S.aureus的光熱抗菌活性,如圖7所示。與“Control”組相比,未添加PEDOT∶PSS,僅用NIR細(xì)菌存活率出現(xiàn)上升,表明NIR對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用;“PEDOT:PSS-only”組細(xì)菌存活率沒(méi)有明顯變化,表明材料本身對(duì)細(xì)菌沒(méi)有毒性;而“PEDOT:PSS＋NIR”組的抗菌效果明顯,菌落數(shù)量顯著降低,MRSA的生存率:僅為0.97%±0.56%,S.aureus的生存率:僅為0.06%±0.10%,表明材料因光熱升溫對(duì)細(xì)菌造成了嚴(yán)重破壞,光熱抗菌效果顯著。進(jìn)一步驗(yàn)證了水溶性PEDOT:PSS應(yīng)用于光熱抗菌領(lǐng)域的巨大潛力。

圖7 PEDOT:PSS光熱治療細(xì)菌S.aureus、MRSA的平板克隆及量化Fig.7 Plate cloning and quantification of PEDOT:PSS photothermal treatment of S.aureus and MRSA

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)合成的水溶性聚合物PEDOT:PSS能將光能高效的轉(zhuǎn)化為熱能,光熱轉(zhuǎn)換效率高達(dá)46.4%;劑 量 在0.5 mg·m L－1時(shí),溶 血 率 僅 為1.83%±0.13%,表明材料具有良好的生物安全性;能有效通過(guò)跨膜穿透細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)進(jìn)去細(xì)菌內(nèi)部,光熱抗菌評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明材料光熱抗菌效果顯著,驗(yàn)證了水溶性聚合物PEDOT:PSS應(yīng)用于光熱抗菌領(lǐng)域的巨大潛力。