杜琨

（武警工程大學(xué)裝備管理與保障學(xué)院，西安 710086）

0 引言

金黃色葡萄球菌是一種致病菌，可引起人類和動(dòng)物化膿感染，也可造成人類食物的中毒[1]。金黃色葡萄球菌在自然界中無(wú)處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。因此，研究乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制或殺滅，對(duì)控制食品中金黃色葡萄球菌的污染、保障食品安全和消費(fèi)者身體健康意義深遠(yuǎn)。

本研究采用生長(zhǎng)曲線測(cè)定、呼吸代謝抑制試驗(yàn)、電導(dǎo)率、可溶性總糖測(cè)定、細(xì)胞壁的變化、蛋白含量和電鏡觀察等針對(duì)性的試驗(yàn)方法，研究乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，為有效地的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)[2-5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)：由本實(shí)驗(yàn)室從高原酸奶中分離得出的乳酸菌，經(jīng)添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、發(fā)酵優(yōu)化、分離、純化和冷凍干燥等制成的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)凍干粉。檢測(cè)指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由陜西師范大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵液效價(jià)檢測(cè)培養(yǎng)基：牛肉膏1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH=7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

TQHZ-2002A恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；GHP-250恒溫培養(yǎng)箱，揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；SB-3S-1無(wú)菌操作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；XY280B不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器設(shè)備有限公司；GHP-250智能光照培養(yǎng)箱，揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；DT1000型電子天平，常熟市衡器廠；紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；JPB-607型便攜式溶解氧分析儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；H-600透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司；TM-1000掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司；Bio-Rad680型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；EC400電導(dǎo)率儀，美國(guó)extech。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性測(cè)定方法

采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法[6-7]。

1.4.2 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

用二倍稀釋法將100 mg/mL的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)溶液進(jìn)行稀釋，吸取2 mL乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)溶液和18 mL融化的培養(yǎng)基同時(shí)放入滅菌的培養(yǎng)皿，調(diào)整pH值為2.5，充分混勻，使乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)最終濃度為100 mg/mL～0.79 mg/mL 8個(gè)梯度。待冷卻后，用接種針劃線在培養(yǎng)基上涂上生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液，用無(wú)菌水作空白對(duì)照組，每個(gè)濃度作3個(gè)重復(fù)。觀察菌體的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)皿中無(wú)菌生長(zhǎng)的，此皿的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)濃度即為其MIC值。

1.4.3 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液作為指示菌懸液。向其中加入MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，每隔3 h取樣，然后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在650 nm下測(cè)定OD值，連續(xù)測(cè)定36 h，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑和OD值為縱坐標(biāo)，分別繪制對(duì)照組和加藥組的生長(zhǎng)曲線和抑菌情況。

1.4.4 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌呼吸代謝的抑制試驗(yàn)[8]

（1）金黃色葡萄球菌菌懸浮液的制備。將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。將菌懸液用4 000 rpm離心10 min，倒掉上清液，用生理鹽水洗滌2次，再用生理鹽水將菌稀釋成1 g/100 mL的懸浮液。

（2）呼吸速率的測(cè)定。呼吸速率是指單位時(shí)間、單位質(zhì)量微生物的耗氧量。根據(jù)菌體懸浮液中溶氧量的變化，可以求出菌體呼吸速率。

典型抑制劑及乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)呼吸速率的測(cè)定:在反應(yīng)杯中加入pH7.2、濃度為0.l mol/L的磷酸鹽緩沖溶液18 mL，1%的葡萄糖溶液2 mL，1%菌體懸浮液5 mL。露空攪拌5 min后開始測(cè)定菌體懸浮液中的溶氧量，測(cè)定時(shí)要保證整個(gè)系統(tǒng)處于密封狀態(tài)。用微注射器分別加入3種典型抑制劑碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉，使其終濃度為0.5 mg/mL，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的終濃度為3.13 mg/mL，以不加抑制劑組為對(duì)照。每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

（3）抑制率的計(jì)算。根據(jù)測(cè)得的呼吸速率，按照下列計(jì)算公式求出典型抑制劑及乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌呼吸的抑制率。其中IR表示抑制率，R0為不添加典型抑制劑時(shí)實(shí)驗(yàn)裝置中金黃色葡萄球菌呼吸速率，R為添加典型抑制劑時(shí)各個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置中金黃色葡萄球菌呼吸速率。

IR（%）=（R0-R）/R×100%

（4）疊加率的計(jì)算。根據(jù)典型呼吸抑制劑加入前、后金黃色葡萄球菌的呼吸速率，用下列公式計(jì)算疊加率。其中RR表示疊加率，R0為添加高原乳酸菌素時(shí)實(shí)驗(yàn)裝置中金黃色葡萄球菌呼吸速率，R為添加高原乳酸菌素和典型抑制劑時(shí)各個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置中金黃色葡萄球菌呼吸速率。

RR（%）=（R0-R）/R×100%

1.4.5 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

參照Lee H.J的方法[9]，將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。向其中加入0、MIC、3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，用EC400電導(dǎo)率儀測(cè)定0、1、2、4、8 h時(shí)培養(yǎng)液的電導(dǎo)率值。

1.4.6 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌可溶性總糖的影響

參照錢紅[10]的方法，將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。向其中加入MIC和3MIC的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，分別在0、1、2、4、6、8、10、12 h時(shí)取1 mL混合液離心(10 000 r/min，2 min)，取上清液稀釋5倍后，取50 μmol/g·min于離心管中，加入200 μmol/g·min蒽酮試劑，在冰浴中冷卻5 min，然后在沸水浴中煮沸10 min，室溫放置10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在620 nm處的吸光值；以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以無(wú)菌水替代乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作為空白對(duì)照。平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.4.7 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的影響

將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。向其中加入MIC和3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，用蒸餾水代替乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作為對(duì)照組，分別在0、1、2、4、6、8、10、12時(shí)取樣，3 500 r/min離心10 min，取上清液采用Malamy等[11]的方法測(cè)定堿性磷酸酶的含量（AKP）。

1.4.8 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液蛋白含量的影響

將金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液作為指示菌懸液。向其中加入MIC濃度和3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，每隔2 h取樣，用比色皿在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595 nm處的吸光值A(chǔ)595，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。同時(shí)將正常培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌用蒸餾水和脫脂奶粉調(diào)節(jié)成同蛋白質(zhì)含量的溶液設(shè)為對(duì)照，蛋白質(zhì)含量按照Bradlford[12]的方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.9原子力顯微鏡觀測(cè)

將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，向其中加入MIC和3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，置于搖床中培養(yǎng)（37℃，130 r/min），取對(duì)照組和不同處理的菌懸液5 μL，涂布到新剝離的云母片上，用2.5%的戊二醛固定10 min，無(wú)菌水漂洗3次，待水分自然風(fēng)干后，用AFM進(jìn)行觀察，圖像均在Tapping模式下獲得，探針為Si3N4（微懸臂長(zhǎng)：200 μm，彈性系數(shù)0.12 N/m），原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行平滑處理與數(shù)據(jù)分析，以未加乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的菌懸液為空白對(duì)照[13-14]。

1.4.10 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌外觀結(jié)構(gòu)的影響

參照Sitohy等[15]的方法，將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，向其中加入MIC和3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，置于搖床中培養(yǎng)（37℃，130 r/min），取對(duì)照組和不同時(shí)間處理的菌懸液5 mL，離心收集菌體，用2.5%的戊二醛固定后，先用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌3次，每次10 min；然后依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脫水各1次，每次10 min；再用無(wú)水乙醇脫水2次，每次10 min；然后依次用50%、70%、90%和100%乙酸異戊酯逐級(jí)置換乙醇，每次置換2 min；將樣品放入超臨界干燥器內(nèi)干燥，最后經(jīng)鍍膜和噴金，置于TM-1000掃描電子顯微鏡下觀察，拍照。

1.4.11 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的影響

將生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng),血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),取生長(zhǎng)量為106CFU/mL的金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，向其中加入MIC和3MIC濃度的乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)，置于搖床中培養(yǎng)（37℃，130 r/min），取對(duì)照組和不同處理的菌懸液5 mL，離心收集菌體，用2.5%的戊二醛固定后，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗滌3次，每次10 min；然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脫水各1次，每次10 min；再用無(wú)水乙醇脫水2次，每次10 min；Epon812定向包埋，用超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，厚度50 nm左右；用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色各30 min，再用蒸餾水沖洗，37℃烘干，用H-600透射電子顯微鏡觀察、拍照[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定結(jié)果

由表1可以看出，當(dāng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的濃度為3.13 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌不能生長(zhǎng)，而當(dāng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的濃度為1.57 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，因而乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.13 mg/mL。

表1 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

2.2 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

從圖1可以看出，對(duì)照組從3 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18～24 h進(jìn)入細(xì)菌穩(wěn)定生長(zhǎng)期，27 h進(jìn)入衰亡期。而加入MIC濃度乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)后，其生長(zhǎng)曲線發(fā)生明顯改變，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受到抑制，菌體的生長(zhǎng)一直處于較低的水平，未出現(xiàn)菌體大量生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。說(shuō)明乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)能夠抑制金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體分裂。

圖1 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

2.3 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌呼吸代謝的抑制試驗(yàn)

（1）乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌呼吸速率的影響。加入乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)及3種典型呼吸抑制劑后對(duì)金黃色葡萄球菌呼吸的抑制結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 典型抑制劑及乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)菌體的抑制率

由表3中可以看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)與3種典型抑制劑相同，都對(duì)金黃色葡萄球菌的呼吸代謝有抑制作用。

表3 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)與典型抑制劑的疊加率

（2）乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)與典型抑制劑間的疊加作用。由表3中可以看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)與丙二酸的疊加率最小，與磷酸鈉的疊加率最大，這表明乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)主要通過(guò)抑制三羧酸循環(huán)途徑起作用。但乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)究竟對(duì)三羧酸循環(huán)中的哪一部位起抑制作用，還有待進(jìn)一步研究。

2.4 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

從圖2中可以看出，向金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中加入乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液電導(dǎo)率明顯增加；還可以看出在0～1 h內(nèi)，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的加入量對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率影響不大，可以排除乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)自身對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響，當(dāng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)加入2 h以后，對(duì)照組的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率變化不大，而乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)加入量為MIC和3MIC的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率顯著增大，說(shuō)明金黃色葡萄球菌細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)大量帶電荷物質(zhì)外滲，引起培養(yǎng)液電導(dǎo)率增高。同時(shí)高原乳酸菌素加入量為MIC和3MIC的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率對(duì)比，變化不大。

圖2 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率的影響

2.5 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的影響

從圖3中可以看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用于金黃色葡萄球菌約2 h時(shí)，細(xì)胞外滲出的堿性磷酸酶的量開始增多，約8 h時(shí)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用的金黃色葡萄球菌的菌懸液中堿性磷酸酶量達(dá)到最大值，隨后趨于平穩(wěn)，和對(duì)照組比較，經(jīng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)處理的金黃色葡萄球菌的菌懸液中堿性磷酸酶量大大增加，說(shuō)明乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁有很強(qiáng)的破壞作用。

圖3 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)胞外堿性磷酸酶含量的影響

2.6 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液糖含量的影響

由圖4可以看出，添加乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)后，培養(yǎng)液中的總糖濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，到8 h時(shí)糖含量增速變緩，說(shuō)明乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的加入破壞了菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)糖類物質(zhì)滲漏到胞外。

2.7 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5中可以看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜滲漏具有顯著的影響，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量增加顯著。測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，添加1MIC乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)12 h的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度為164.87 μg/mL，添加3MIC乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)12 h的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度為187.32 μg/mL，而未加乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)處理的對(duì)照培養(yǎng)液中蛋白濃度僅為80.23 μg/mL。排除乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)自身蛋白的影響后可以推斷，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的加入使金黃色葡萄球菌細(xì)胞破裂，細(xì)胞質(zhì)外泄，細(xì)胞質(zhì)中大量的蛋白質(zhì)進(jìn)入培養(yǎng)液中，從而引起培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的提高。（MIC乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)溶液蛋白質(zhì)含量為：6.25 μg/mL）。

圖5 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的影響

2.8 原子力顯微鏡觀測(cè)

圖6可清晰的看到未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌的結(jié)構(gòu)呈規(guī)則球形，形態(tài)飽滿，表面光滑平坦，直徑約為1 μm。圖7為乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用3 h時(shí)的金黃色葡萄球菌AFM圖，從圖中可以看出，菌體細(xì)胞膨脹，細(xì)菌細(xì)胞外壁被破壞的數(shù)量越來(lái)越多，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌破裂的細(xì)胞。圖8為乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用9 h的金黃色葡萄球菌AFM圖，從圖中可以看出，大量細(xì)胞破損，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，有的細(xì)胞已經(jīng)死亡。

圖6 對(duì)照組金黃色葡萄球菌正常細(xì)胞表面狀態(tài)圖

圖8 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用9 h金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面狀態(tài)圖

2.9 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的外觀結(jié)構(gòu)的影響

掃描電鏡下觀察，圖9對(duì)照組金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁表面光滑、圓潤(rùn)，呈球狀，細(xì)胞與細(xì)胞間界限分明，細(xì)胞排列呈明顯的葡萄串狀，與胡靜等報(bào)道一致[30]。圖10經(jīng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用3 h，金黃色葡萄球菌的排列變得松散，有的已經(jīng)不能聚集成葡萄狀，表明金黃色葡萄球菌的不定向分裂受到抑制。圖11經(jīng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用9 h，大部分金黃色葡萄球菌嚴(yán)重扭曲變形，干癟、皺縮，表面粗糙，有的菌體表面有明顯的凹陷、囊泡狀或不規(guī)則的突起結(jié)構(gòu)。有的細(xì)胞泄露物在細(xì)胞周圍聚集，黏結(jié)成團(tuán)塊狀，說(shuō)明菌體細(xì)胞已被破壞。

圖9 對(duì)照組金黃色葡萄球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

圖10 作用3 h金黃色葡萄球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

圖11 作用9 h金黃色葡萄球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)圖

2.10 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖12看出，透射電鏡下正常的金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜完整，結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁，基本無(wú)空隙存在，胞質(zhì)均勻，核區(qū)明顯。由圖12看出,經(jīng)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用3 h，菌體有些變形、溶脹，位于細(xì)胞膜區(qū)出現(xiàn)一些小的空泡。由圖14看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用9 h后，細(xì)胞質(zhì)固縮，導(dǎo)致細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間空隙明顯增寬，質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁疏松出現(xiàn)皺折，部分細(xì)胞壁與隔膜模糊不清，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)許多空腔。

圖12 對(duì)照組金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)圖

圖13 作用3 h金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)圖

圖14 作用9 h金黃色葡萄球菌超微結(jié)構(gòu)圖

3 結(jié)論

本文以金黃色葡萄球菌為待測(cè)菌株，通過(guò)一系列生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，并初步揭示了相應(yīng)的抑菌機(jī)制。從細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的對(duì)比結(jié)果可以看出，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)能夠抑制金黃色葡萄球菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體分裂。細(xì)胞呼吸抑制試驗(yàn)結(jié)果表明乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的呼吸代謝有抑制作用，抑制方式主要是通過(guò)抑制TCA途徑起作用。通過(guò)乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)添加前后的對(duì)比研究表明，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)能明顯改變金黃色葡萄球菌的電導(dǎo)率、糖含量、蛋白質(zhì)含量和堿性磷酸酶的含量，這是由于乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)改變了金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性，造成胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)菌體外漏程度進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)還能引發(fā)金黃色葡萄球菌菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。原子力顯微鏡觀察到用乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)處理的金黃色葡萄球菌菌體失去正常形態(tài)，大量細(xì)胞破損，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，部分細(xì)胞發(fā)生死亡。透射電鏡和掃描電鏡的觀察結(jié)果表明金黃色葡萄球菌隨乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)作用時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體逐漸出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，胞質(zhì)逐漸減少，細(xì)胞膜逐漸缺失，菌體出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。綜上所述，乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)理是破壞細(xì)胞膜和抑制生物大分子的合成，使菌體細(xì)胞膜受損，表面形成孔洞，造成菌體細(xì)胞內(nèi)容物的外泄從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。