姚程晨，楊麗梅，林立

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（北京市食品檢驗(yàn)所），國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094）

0 引言

我國(guó)每年出生的新生兒中都會(huì)有部分新生嬰兒由于受各種疾病的影響，其生命初期或相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間里母乳或其他普通嬰兒配方食品不能完全滿足其所需的營(yíng)養(yǎng)需求，而特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品的出現(xiàn)不僅可以提供這部分新生嬰兒所需的營(yíng)養(yǎng)，也可以作為其賴以生存的唯一或主要的食物來(lái)源[1-3]。牛磺酸又稱β-氨基乙磺酸，分子式為HO3S-CH2-CH2-NH2，分子量為125.2 u，對(duì)人體起著十分重要的生理調(diào)節(jié)作用，尤其是增強(qiáng)免疫力和抗疲勞。?；撬峥梢砸鸫x物的變化，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、抗氧化能力，可被作為生化試劑和潤(rùn)滑劑來(lái)使用，缺乏?；撬釙?huì)引起視網(wǎng)膜功能紊亂[4-12]。

目前測(cè)定?；撬岬闹饕椒ㄓ邪被岱治龇?、分光光度法、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法、傅立葉變換紅外線光譜法[13-17]等。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品在世界各國(guó)均作為特殊膳食用食品進(jìn)行管理[18-19]，2015年起我國(guó)逐步完善對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的監(jiān)管，并明確了其作為食品的法律屬性[20]。針對(duì)嬰幼兒配方乳粉樣品可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y(cè)定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法進(jìn)行檢測(cè)[21]。但是特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品復(fù)雜，牛磺酸受基質(zhì)干擾明顯，分離度差，衍生不充分，檢測(cè)結(jié)果不理想[22-24]。

本方法在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.169-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中?；撬岬臏y(cè)定》第二法丹磺酰氯柱前衍生法的基礎(chǔ)上對(duì)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品樣品稀釋后再進(jìn)行衍生優(yōu)化，選用資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱分離效果好，可以很好的消除其他氨基酸引起的基質(zhì)干擾，滿足分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 樣品

市售的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品，包括：無(wú)乳糖配方或低乳糖配方，乳蛋白部分水解配方，乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方，早產(chǎn)、低出生體重嬰兒配方。

1.1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、鹽酸（分析純）、甲胺鹽酸鹽（分析純）、乙酸鈉（分析純）、冰乙酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；丹磺酰氯(色譜純)，美國(guó)Alfa Aesar公司；乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（Taurine，CAS：107-35-7，純度：99.8%），sigma。

1.1.3 儀器與設(shè)備

安捷倫高效液相色譜分析儀1260（配有二極管陣列檢測(cè)器（DAD）以及熒光檢測(cè)器（FLR）)及OpenLAB CDS ChemStation Edition for LC & LC/MS Systems數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國(guó)安捷倫公司；百分之一分析天平（型號(hào)ME802，d=0.01 g)、千分之一分析天平（型號(hào)ME203T，d=1 mg），瑞士梅特勒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取約10 mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL。將牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋配制成濃度分別為：1、2、10、20、50 μg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，臨用前現(xiàn)配。

1.2.2 試劑配制

碳酸鈉緩沖液：稱取0.424 g無(wú)水碳酸鈉，加40 mL水溶解，用鹽酸溶液調(diào)pH至9.5，用水定容至50 mL。

丹磺酰氯溶液：稱取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100 mL。臨使用前配制。

甲胺鹽酸鹽：取2.00 g鹽酸甲胺，用水溶解并定容至100 mL。

乙酸鈉緩沖液：稱取0.82 g乙酸鈉，加入800 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.2，用水定容至1 000 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.50 g（精確到0.01 g）待測(cè)樣品，用20 mL 40℃左右的溫水溶解后振蕩混勻超聲提取，再分別加入1 mL乙酸鋅溶液和1 mL亞鐵氰化鉀溶液搖勻，繼續(xù)振蕩，用超純水定容至50 mL，搖勻，8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.4 樣液稀釋、衍生

取上清液用水稀釋10倍后待用。吸取1 mL待測(cè)液到玻璃試管中，加入1 mL碳酸鈉緩沖液，以及1 mL丹磺酰氯溶液，充分振蕩混合，室溫避光衍生反應(yīng)2 h（1 h后需搖晃1次），加入0.1 mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合，以終止反應(yīng)，避光靜置至沉淀完全。取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后供高效液相色譜分析儀檢測(cè)。

另取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液用水稀釋10倍搖勻待用，取1 mL與試液同步進(jìn)行衍生。供高效液相色譜分析儀檢測(cè)。

1.3 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器及波長(zhǎng)：二極管陣列檢測(cè)器，254 nm；流動(dòng)相：乙酸鈉緩沖液+乙腈,梯度洗脫程序如表1所示。

表1 ?；撬岬南疵撎荻缺?/p>

1.4 結(jié)果計(jì)算

按照下式計(jì)算試樣中?；撬岬暮浚?/p>

式中：X為試樣中牛磺酸的含量(mg/100 g)；c為試樣測(cè)定液中牛磺酸的濃度(μg/mL)；V為試樣定容體積(mL)；m為試樣質(zhì)量(g)，100為將結(jié)果單位由毫克每克換算為毫克每百克樣品中含量的換算系數(shù)；1 000為將濃度單位由ng/mL換算為μg/mL的換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

同時(shí)比較了Agilent zorbax Eclipse XDB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱、Agilent zorbax SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱和資生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物分離的影響。如圖1所示，?；撬嵩赬DB-C18柱和SB-C18上分離度較差；在PAK C18柱上分離度均較好，所以最終選擇資生堂CAPCELL PAK C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分析。

圖1 不同色譜柱分離?；撬岬囊合嗌V圖

流動(dòng)相的選擇對(duì)目標(biāo)化合物的分離、峰形有很大的影響。本文研究比較了10 mmol/L乙酸鈉水溶液和乙腈的等度洗脫和梯度洗脫對(duì)?；撬嵘V峰的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜等度洗脫無(wú)法很好分離?；撬崮繕?biāo)峰，對(duì)于結(jié)果數(shù)據(jù)有明顯的影響，而流動(dòng)相梯度洗脫的?；撬岱蛛x度較好、響應(yīng)值高，因此選擇10 mmol/L乙酸鈉水溶液和乙腈的梯度洗脫作為流動(dòng)相。

2.2 蛋白質(zhì)沉淀優(yōu)化

由于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜，考慮蛋白質(zhì)沉淀是否充分。有研究對(duì)比了乙腈、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑沉淀嬰幼兒配方奶粉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞鐵氰化鉀與乙酸鋅的混合試劑效果最好[25]。現(xiàn)選擇3種蛋白質(zhì)沉淀方法進(jìn)行比較，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)法，調(diào)節(jié)pH酸堿變性蛋白沉淀法，磺基水楊酸蛋白質(zhì)沉淀法。

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)法是利用乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來(lái)挾走或吸附干擾物質(zhì)，這種方法除蛋白質(zhì)能力強(qiáng)。

酸堿變性沉淀法改變了蛋白質(zhì)pH環(huán)境，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則排列，其物理性質(zhì)也發(fā)生改變，并失去原有的生理活性，即蛋白質(zhì)發(fā)生變性，變性蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小且以沉淀的形式從溶液中析出。這種方法除蛋白質(zhì)能力較弱。

磺基水楊酸蛋白質(zhì)沉淀法是利用生物堿制劑磺基水楊酸在酸性環(huán)境下，其陰離子可與帶正電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性蛋白鹽而沉淀。這種方法除蛋白質(zhì)能力稍差，個(gè)別樣品除蛋白后依然出現(xiàn)渾濁狀態(tài)。

用3種蛋白質(zhì)沉淀方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比如，圖2所示。結(jié)果表明用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白質(zhì)后測(cè)得的樣品中牛磺酸含量更接近其對(duì)應(yīng)標(biāo)簽明示值。

圖2 不同沉淀蛋白方式的牛磺酸結(jié)果

2.3 樣液稀釋及衍生優(yōu)化

沉淀后上清液分別用水進(jìn)行稀釋，得到原樣液、5倍稀釋液、10倍稀釋液、20倍稀釋液，進(jìn)行衍生優(yōu)化對(duì)比。4個(gè)濃度待測(cè)液按照1.2.4樣液稀釋、衍生步驟操作。

另取標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液用水進(jìn)行稀釋，得到原標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液、5倍稀釋工作液、10倍稀釋工作液、20倍稀釋工作液，同時(shí)進(jìn)行上述衍生，得到4條衍生后的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，供高效液相色譜分析儀檢測(cè)。

當(dāng)原樣液、5倍稀釋液時(shí)，得到樣品中?；撬岬暮枯^低，稀釋10倍時(shí)樣品中?；撬岬暮枯^高，接近標(biāo)簽明示值，稀釋10倍、20倍時(shí)樣品中?；撬岬暮拷咏?。但由于稀釋倍數(shù)越大誤差越大，且目標(biāo)物在儀器上響應(yīng)值越低。因此選擇10倍稀釋液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不同稀釋倍數(shù)下?；撬岬臏y(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 不同稀釋倍數(shù)下?；撬岬臏y(cè)定結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

配制?；撬針?biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)HPLC檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所得線性回歸方程為y=4.427x+1.197，在質(zhì)量濃度1～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，滿足分析要求。?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中?；撬岬腍PLC圖如圖3所示。采用逐步稀釋法，以基線3倍信噪比對(duì)最低檢測(cè)限進(jìn)行測(cè)定，方法檢出限為0.53 mg/100 g；以基線10倍信噪比對(duì)定量限進(jìn)行測(cè)定，方法定量限為1.60 mg/100 g。

圖3 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的HPLC圖

2.5 方法回收率和精密度

選取具有代表性的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。添加3個(gè)水平濃度?；撬針?biāo)準(zhǔn)品。在最優(yōu)條件下進(jìn)行樣品前處理,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。由表3可知，3個(gè)添加水平下加標(biāo)回收率范圍為89.6%～103.9%，精密度（RSD）為0.19%～5.02%。

表3 特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品3水平加標(biāo)回收率和精密度

（續(xù)表3）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)8批次特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中牛磺酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量，并與其標(biāo)簽明示值進(jìn)行比較。由表4可知，本實(shí)驗(yàn)方法中牛磺酸含量與其對(duì)應(yīng)標(biāo)簽明示值無(wú)顯著差異，表明采用本方法測(cè)得?；撬峤Y(jié)果可靠。

表4 部分市售樣品?；撬岷考捌錁?biāo)簽明示值

3 結(jié)論

本方法采用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液沉淀蛋白法沉淀蛋白，并將樣液稀釋10倍后再衍生的柱前衍生前處理方式，用資生堂CAPCELL PAK C18，5 μm，4.6×250 mm色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，建立高效液相色譜儀測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒食品中牛磺酸含量的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度1～50 μg/mL范圍內(nèi)，?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系；該方法的檢出限為0.53 mg/100 g，定量限為1.60 mg/100 g；加標(biāo)回收率范圍為89.6%～103.9%，精密度（RSD）為0.19%～5.02%。本方法靈敏高效、衍生充分、回收率優(yōu)良、重復(fù)性穩(wěn)定，適用于特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中?；撬岬臋z測(cè)。