包秋華，王會瑩，張雨虹

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

0 引言

代謝組學(xué)（Metabolomics）是專門用來研究一個(gè)生物體的基因或其所在的環(huán)境發(fā)生變化后，它具有內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的品種、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)，可以對某生物或細(xì)胞在一定特殊時(shí)期的所有比較低的分子質(zhì)量代謝物（<1 000）進(jìn)行定性或定量分析的一門學(xué)科[1-2]。超高效液相色譜-四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Ul

tra-performance liquid chromatography-quadrupoletime of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）是代謝組學(xué)研究中使用廣泛的分析工具之一，具有較高的色譜峰分辨率、較短的分析時(shí)間和較強(qiáng)的檢測靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種復(fù)雜樣品微量成分的分離和分析[2-3]。

一些細(xì)菌在不利生長的逆境脅迫條件下會進(jìn)入一種活的非可培養(yǎng)（Viable but nonculturable，VBNC）態(tài)，其在常規(guī)培養(yǎng)基上無法生長，但仍具有低的代謝活性，當(dāng)條件適宜時(shí)又可以恢復(fù)生長繁殖能力復(fù)蘇到可培養(yǎng)態(tài)[4-5]。目前已證實(shí)100多種微生物（包括細(xì)菌、真菌）可進(jìn)入VBNC態(tài)[4-5]。不同種類的微生物VBNC態(tài)復(fù)蘇方法不盡相同，常見的復(fù)蘇方法有升溫法、添加有機(jī)物法、富營養(yǎng)法、生物法等[4-10]。致病菌VBNC態(tài)的復(fù)蘇會給食品安全和人類健康帶來潛在威脅[4-11]。非致病菌的復(fù)蘇可能會增加活菌數(shù)量、利于挖掘自然界中不可培養(yǎng)微生物資源等[12-13]。目前對微生物VBNC態(tài)的復(fù)蘇機(jī)理尚不明確。由于不同微生物在不同復(fù)蘇條件下代謝變化不盡相同，是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，因此分析不同復(fù)蘇條件下代謝物差異將有利于解析其復(fù)蘇機(jī)理。

干酪乳酪桿菌Zhang（Lacticaseibacillus casei Zhang，縮寫L.casei Zhang）是分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中一株具有耐酸、耐膽鹽、抗氧化、改善腸道菌群等多種益生功能的乳桿菌，是我國完成的第一株全基因組測序的乳酸菌[14-17]。需要補(bǔ)充說明的是此菌根據(jù)2020年乳桿菌屬的分類地位變遷[18]才改為現(xiàn)在的名稱。以前稱為Lacticaseibacillus casei Zhang或L.casei Zhang，目前該菌已經(jīng)在食品、美妝、醫(yī)藥及畜牧業(yè)等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[15-18]。

前期研究發(fā)現(xiàn)益生菌L.casei Zhang在某些逆境條件下能夠進(jìn)入VBNC態(tài)[19]。關(guān)于益生菌在不同基質(zhì)中復(fù)蘇的代謝物差異變化鮮有報(bào)道，因此本試驗(yàn)主要利用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)，對L.casei Zhang VBNC態(tài)在二種常用的乳酸菌活化培養(yǎng)基（液體MRS培養(yǎng)基和脫脂乳）中復(fù)蘇的差異代謝物進(jìn)行檢測和分析，旨在從代謝組學(xué)的角度對其復(fù)蘇機(jī)理進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

本實(shí)驗(yàn)所用L.casei Zhang由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

乙腈（色譜級）、甲醇（色譜級），CNW科技公司；異亮氨酸腦啡肽，美國Waters公司；氨水（色譜級），Sigma公司；MRS液體培養(yǎng)基、脫脂乳，Oxoid公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-Tof超高效液相-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF MS），美國Waters公司；MoFlo AstriosEQ流式細(xì)胞分選儀，美國Beckman Coulter有限公司；Milli-Q純水儀，Millipore公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司。

1.2 方法

1.2.1 L.casei Zhang的誘導(dǎo)及復(fù)蘇

參照陳鹿[11]、王亞利[12]等人方法將活化的L.casei Zhang在液體MRS培養(yǎng)基（pH3.8）中在4℃低溫條件下180 d左右使其進(jìn)入VBNC態(tài)，然后采用MoFlo AstriosEQ流式分選細(xì)胞儀對L.casei Zhang VBNC誘導(dǎo)液按細(xì)胞亞群（活菌、死菌和VBNC態(tài)）進(jìn)行分區(qū)，將其VBNC態(tài)細(xì)胞分選入指定管（專利需要，數(shù)據(jù)略），分別接入脫脂乳和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，傳三代至復(fù)蘇。

1.2.2 UPLC-Q-TOF MS分析

（1）樣品前處理。參照彭江英[20]等乳清樣本前處理方法，即：取兩種復(fù)蘇樣品各1 mL于5 mL EP管中，加入1/3體積的乙腈，充分混勻，10 000 g高速離心10 min，吸取上清液于新的5 mL EP管中，加入1/3體積的乙腈，充分混勻，4℃靜置2 h，12 000 g離心5 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮9 h后，加1 mL 40%乙腈溶液復(fù)溶，8 000 g離心5 min后用0.22 μm微孔濾膜過濾于上樣瓶中，上機(jī)測定。將每個(gè)樣品各吸15 μL加入同一上樣瓶中，與待測樣品以同樣的方式進(jìn)行處理后，作為質(zhì)量檢測（Quality control，QC）樣本。

（2）高效色譜條件。色譜柱：Waters BEHC18；設(shè)定柱狀烘箱溫度：35℃；流速：0.45 mL/min；每個(gè)樣品的進(jìn)樣量：10 μL。正離子掃描模式下：流動(dòng)相由溶劑A（水＋0.1%甲酸）和溶劑B（0.1%甲酸+乙腈）組成；負(fù)離子掃描模式下：流動(dòng)相由溶劑A（水＋0.1%氨水）和溶劑B（純乙腈溶液）組成。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

需要補(bǔ)充說明的是梯度洗脫中梯度變化的速率會影響物質(zhì)的出峰時(shí)間和分離效果，實(shí)際測樣過程中主要根據(jù)分離結(jié)果來調(diào)整梯度變化的速率。本研究所采取的洗脫速率，樣品中的物質(zhì)可以達(dá)到最佳的分離效果。

（3）質(zhì)譜條件。參照馬立清[21]等質(zhì)譜條件的設(shè)定，質(zhì)譜采用ESI源正、負(fù)離子（ESI+/ESI-）模式進(jìn)行采集，質(zhì)核比掃描范圍設(shè)定在50～1 000 m/z。為確保儀器的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，采用濃度為2 ng/mL亮氨酸腦啡肽為校正液（正離子模式下質(zhì)荷比設(shè)定為556.277 1 m/z，負(fù)離子模式下質(zhì)荷比設(shè)定為554.261 5 m/z），具體參數(shù)設(shè)置為：毛細(xì)管電壓2.5 kV，樣品錐孔電壓40 kV，離子源溫度100℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流速50 h/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)過UPLC-Q-TOF MS獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)化及預(yù)處理后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件結(jié)合Metaboanalyst 5.0進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等。依據(jù)P<0.05，F(xiàn)C>2和VIP≥1相結(jié)合的條件篩選獲得差異代謝物。篩選出的差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配確定最終差異代謝物。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種復(fù)蘇基質(zhì)下的PCA圖分析

利用UPLC-Q-TOF MS代謝組學(xué)技術(shù)研究L.casei Zhang VBNC態(tài)在兩種復(fù)蘇基質(zhì)中的代謝物質(zhì)。測試數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在正離子和負(fù)離子模式下分別得到2 735種和1 717種代謝物。由于主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是一種常用的無監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)方法，通過將多維數(shù)據(jù)降維轉(zhuǎn)化成幾個(gè)綜合主成分來評估樣本的分類狀態(tài)[21]?？梢苑磻?yīng)不同樣品的分組情況以及整體數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性[20]。所以本文對兩種復(fù)蘇基質(zhì)的樣品進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見圖1。

圖1 兩種復(fù)蘇狀態(tài)下PCA圖分析

PCA圖中樣本點(diǎn)之間的距離能反映樣本間代謝物的相似性和差異性。由圖1可知，在ESI+和ESI-模式下，QC樣本相對聚集，表明數(shù)據(jù)采集過程中儀器具有較高的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，所得數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確。L.casei Zhang VBNC態(tài)在MRS培養(yǎng)基（編號為MRS）、脫脂乳(編號為TZR)兩種復(fù)蘇基質(zhì)樣本中組內(nèi)分布相對聚集，平行性較好；組間分離明顯，說明兩組樣本代謝物具有明顯差異。

2.2 兩種復(fù)蘇基質(zhì)下的OPLS-DA圖分析

PCA分析雖能通過原始數(shù)據(jù)直觀反映兩組樣本間的整體差異，但無法消除隨機(jī)以及組內(nèi)誤差，為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，可運(yùn)用OPLS-DA（正交偏最小二乘法-判別分析）法，除去自變量X中與隨機(jī)變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)，使得分類數(shù)據(jù)集中在一個(gè)主成分中，用于評估OPLS-DA圖是否存在過擬合情況[22]。OPLS-DA結(jié)果見圖2。判別分析具體參數(shù)結(jié)果如下，圖2（a）（正離子模式）：R2Y=1，Q2=0.995；圖2（b）（負(fù)離子模式）：R2Y=1，Q2=0.991。其中R2Y表示所建模型對Y軸方向的解釋率，Q2表示對模型的預(yù)測能力，R2Y和Q2結(jié)果越接近1，說明模型越穩(wěn)定可靠[23]。本試驗(yàn)中R2Y結(jié)果均等于1，Q2結(jié)果均接近于1，表明在正離子和負(fù)離子兩種模式下，MRS培養(yǎng)基（編號為MRS）、脫脂乳(編號為TZR)兩種復(fù)蘇樣品組內(nèi)分布相對聚集，平行性較好；組間分離良好，兩種樣品在復(fù)蘇過程中產(chǎn)生的代謝物在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在明顯差異，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 兩種復(fù)蘇狀態(tài)下OPLS-DA圖分析

由于OPLS-DA分析方法在代謝數(shù)據(jù)樣本量小的情況下會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不準(zhǔn)確，因此需要采用置換檢驗(yàn)來驗(yàn)證OPLS-DA檢測結(jié)果是否為假陽性[23]。正、負(fù)離子模式下200次隨機(jī)置換檢驗(yàn)結(jié)果見圖3。通常R2的截距應(yīng)明顯小于模型變量的解釋度，Q2的截距也應(yīng)該明顯小于預(yù)測度[22]。由圖3中可以看出Q2截距小于R2，說明OPLS-DA模型有效，數(shù)據(jù)不存在假陽性。

圖3 兩種復(fù)蘇狀態(tài)下置換檢驗(yàn)圖分析

2.3 兩種復(fù)蘇基質(zhì)下細(xì)胞差異代謝物的篩選

L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS和脫脂乳中的復(fù)蘇樣本經(jīng)過UPLC-Q-TOF MS獲得的原始數(shù)據(jù)預(yù)處理后，在正離子和負(fù)離子模式下分別得到2 735種和1 717種代謝物，隨后根據(jù)P<0.05、FC>2和VIP≥1的篩選原則，并通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對鑒定得到了22個(gè)主要差異代謝物，具體差異代謝物見表2。

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)在2種不同復(fù)蘇基質(zhì)下篩選出的22個(gè)主要差異代謝物，分為氨基酸類、糖類、維生素類、脂類和嘌呤類共5類。其中，有18種代謝物（甘氨酸、L-谷氨酰胺、賴氨酸、L-瓜氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、D-氨基葡萄糖、低聚木糖、煙酰胺、甲基鈷胺素水合物、亞葉酸、甲萘醌、棕櫚酸、4-氨基丁酸酯、甘油、3'-磷酸腺苷硫酸酯、鳥苷和黃嘌呤）在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中的相對含量高于在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中；有4種代謝物（S-核糖基-L-高半胱氨酸、乳糖、核黃素和(R)-3-羥基丁酸酯）在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中的相對含量高于在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中。這些差異代謝物的合成可能對L.casei Zhang VBNC態(tài)復(fù)蘇起關(guān)鍵作用。下面對主要差異代謝物按類進(jìn)行分析。

表2 L.casei Zhang VBNC態(tài)在MRS和脫脂乳中復(fù)蘇的差異代謝物

（續(xù)表2）

2.4 主要差異代謝物的分類分析

2.4.1 氨基酸類

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS和脫脂乳兩種復(fù)蘇基質(zhì)中主要氨基酸類差異代謝物有7種，其中在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中主要氨基酸差異代謝物有6種（包括甘氨酸、L-谷氨酰胺、賴氨酸、L-瓜氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸）。有研究表明氨基酸是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料，是調(diào)節(jié)代謝，增加抵抗力所需物質(zhì)[24]。L-蘇氨酸可由糖類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化而成，甘氨酸既可以由糖類物質(zhì)生物合成，也可以由前述的L-蘇氨酸通過生物轉(zhuǎn)化合成。同時(shí)甘氨酸的積累能對菌株生長提供所需的氮源，同時(shí)也能促進(jìn)菌株體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[25]。另外，L-谷氨酰胺主要通過谷氨酰合成酶和谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化而成，L-谷氨酰胺有效降低菌在逆境脅迫中受到的氧化損傷程度，并提高釀酒酵母的活力[26]。對于大腸桿菌VBNC態(tài)復(fù)蘇的研究過程中，通過向培養(yǎng)基中添加不同的氨基酸組合可使細(xì)胞從VBNC狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)蘇態(tài)[27]。因此推測在MRS基質(zhì)中積累的6種氨基酸對L.casei Zhang VBNC態(tài)的復(fù)蘇發(fā)揮一定作用。

在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中主要氨基酸差異代謝物是S-核糖基-L-高半胱氨酸。由于半胱氨酸是生物體內(nèi)常見的硫源供體，L-半胱氨酸是蛋氨酸、硫胺素以及谷胱甘肽等生物體內(nèi)常見物質(zhì)的重要組成成分[28]。因此推測S-核糖基-L-高半胱氨酸在脫脂乳中的積累對L.casei Zhang VBNC態(tài)的復(fù)蘇發(fā)揮作用。

2.4.2 糖類

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS和脫脂乳兩種復(fù)蘇基質(zhì)中主要糖類的差異代謝物有3種，其中在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中顯著增加的有低聚木糖和D-氨基葡萄糖。低聚木糖是由2～9個(gè)木糖分子通過β-1,4糖苷鍵連接而成，近年來的研究表明，低聚木糖具有多種生物活性，低聚木糖可作為益生元可為雙岐桿菌和乳酸菌供能，從而刺激菌體的生長和增值[29-30]。由此推測在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中低聚木糖的積累有利于L.casei Zhang VBNC態(tài)菌復(fù)蘇。此外，在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中顯著增加的是乳糖，糖類提供菌株生長過程中的營養(yǎng)物質(zhì)，有利于L.casei Zhang VBNC態(tài)的復(fù)蘇。

2.4.3 維生素類

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)在兩種復(fù)蘇基質(zhì)中有顯著差異的維生素為煙酰胺、核黃素、甲基鈷胺素水合物、亞葉酸和甲萘醌。由于煙酰胺參與生物體內(nèi)糖原分解、脂類代謝及各種物質(zhì)的氧化作用，是一種潛在抗氧化性物質(zhì)[31]。嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗汁后的代謝產(chǎn)物中煙酰胺含量增加[31]。與本文結(jié)果煙酰胺含量增加結(jié)果一致，因此推測L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS復(fù)蘇的過程中，L.casei Zhang抗氧化能力被逐漸恢復(fù)。此外，核黃素是生物體內(nèi)作為重要輔酶黃素腺嘌呤二核甘酸（FAD）和黃素單核甘酸（FMN）的前體存在，能促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的代謝[32]。相較于MRS培養(yǎng)基，在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中核黃素含量明顯增加，因此，推測核黃素對L.casei Zhang VBNC態(tài)在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中起作用。

2.4.4 脂類

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS和脫脂乳兩種復(fù)蘇基質(zhì)中主要脂類的差異代謝物有5種。其中在液體MRS復(fù)蘇基質(zhì)中顯著增加的脂類有4種（棕櫚酸、4-氨基丁酸酯等物質(zhì)），在脫脂乳復(fù)蘇基質(zhì)中顯著增加的有1種（（R）-3-羥基丁酸酯）。由于脂類是維持菌體正常生長所必需的物質(zhì)，能促進(jìn)脂溶性維生素吸收和利用，可作為能量和碳源的儲存物質(zhì)，因此脂類物質(zhì)的增加對VBNC態(tài)菌株的復(fù)蘇及生長發(fā)揮著重要的作用。

2.4.5 嘌呤類

從表2可以看出，L.casei Zhang VBNC態(tài)經(jīng)液體MRS復(fù)蘇后，鳥苷（嘌呤）和黃嘌呤這2種核苷酸代謝物呈顯著性增加的趨勢。由于嘌呤是細(xì)胞內(nèi)最主要的小分子代謝物之一，是遺傳信息傳遞的基礎(chǔ)、核苷酸的重要組成部分，是儲存能量的主要生物分子[33]。因此推測2種嘌呤類物質(zhì)為L.casei Zhang VBNC態(tài)的生長代謝提供了一定的條件。

3 結(jié) 論

本研究利用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)對L.casei Zhang VBNC態(tài)在液體MRS培養(yǎng)基和脫脂乳二種復(fù)蘇基質(zhì)中的代謝物進(jìn)行解析，通過多變量統(tǒng)計(jì)分析共篩選出差異代謝物22種，其中甘氨酸、低聚木糖、煙酰胺等18個(gè)代謝物在液體MRS培養(yǎng)基中的相對含量顯著高于脫脂乳，其余4種（S-核糖基-L-高半胱氨酸、乳糖、核黃素和(R)-3-羥基丁酸酯）代謝物在脫脂乳中高，推測22種化合物的合成在L.casei Zhang VBNC態(tài)復(fù)蘇過程中起關(guān)鍵作用，也表明了液體MRS培養(yǎng)基的復(fù)蘇效果好于脫脂乳。該研究為L.casei Zhang VBNC態(tài)的復(fù)蘇機(jī)理提供參考。