宋 洋

（寧德市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，福建寧德 352100）

食品安全歷來備受人們的重視，食品中微生物污染能夠影響食品安全[1-2]。人體攝入被微生物污染的食品后，容易引起食源性疾病，危害人們的身心健康。食品微生物檢驗(yàn)是運(yùn)用微生物學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)方法，對食品中所含微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)及其對人體的健康的影響進(jìn)行判斷，進(jìn)而判別食品是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢驗(yàn)方法。開展食品微生物檢驗(yàn)可以在一定程度上保障食品安全，食品中微生物菌落總數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目是食品微生物檢驗(yàn)的常見項(xiàng)目，作為評價(jià)食品微生物污染狀況的指標(biāo)之一，可以直觀反映食品中微生物數(shù)量[3-4]。為了開展食品中微生物菌落總數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常會使用到平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（Plate Count Agar，PCA），但在實(shí)際工作中，存在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配制過多，實(shí)驗(yàn)后剩余培養(yǎng)基保存后能否再次使用的問題[5]。實(shí)驗(yàn)研究不同的貯存條件和滅菌次數(shù)對PCA 培養(yǎng)基質(zhì)量的影響，判斷其是否符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）要求[6]。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸埃希氏菌 CMCC（B）44102（批號：220218；產(chǎn)品號：33053；規(guī)格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發(fā)公司；金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，（批號：220216；產(chǎn)品號：33025；規(guī)格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發(fā)公司；枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501（批號：220812；產(chǎn)品號：33031；規(guī)格：500～1 000 CFU/顆），來自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）（批號：1100441），廣東環(huán)凱微生物有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號：1103601），廣東環(huán)凱微生物有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

MLS-3751L-PC 高壓蒸汽滅菌器，日本三洋電子科技有限公司；GNP-9270 型隔水氏恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HFsafe-1200 生物安全柜，上海力申科學(xué)儀器有限公司；HYC-940 醫(yī)用冷藏箱青島海爾股份有限公司；YP3002 電子天平，余姚金諾天平儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)（E-201-P平面pH 復(fù)合電極），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的處理方法

（1）培養(yǎng)基配制及滅菌方法。準(zhǔn)確稱取平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），加入對應(yīng)量的超純水，煮沸至溶解，121 ℃高壓滅菌15 min。

（2）培養(yǎng)基滅菌方法。第1 d 配制兩份PCA 培養(yǎng)基并分別編1 號和2 號，滅菌后，取出自然冷卻，將1 號放入常溫潔凈環(huán)境存放3 d，將2 號放入潔凈冰箱4 ℃存放3 d，第4 d 配制3 號PCA 培養(yǎng)基并滅菌，待3 號自然冷卻后，與新配制的4 號PCA 培養(yǎng)基一起放入滅菌，滅菌后自然冷卻3 號和4 號，再將3 號、4 號與新配制的5 號PCA 培養(yǎng)基和TSA 培養(yǎng)基一起滅菌，隨后將1 號和2 號沸水浴加熱融化。上述培養(yǎng)基每份大約配制150 mL。

1.4.2 培養(yǎng)基性能測定

（1）理化特性。①外觀性狀。平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的色澤、均勻度等變化。②pH 值。培養(yǎng)基滅菌或融化后倒入無菌平皿制成平板，冷卻至25 ℃時(shí)，測定平板上3 個(gè)不同位置的pH 值，取其平均值。③培養(yǎng)基質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取空瓶質(zhì)量、滅菌前加入培養(yǎng)基后質(zhì)量、滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量、貯存后培養(yǎng)基的質(zhì)量。④質(zhì)量減少率。培養(yǎng)基質(zhì)量減少率=培養(yǎng)基減少的質(zhì)量/培養(yǎng)基滅菌前質(zhì)量，培養(yǎng)基減少質(zhì)量=滅菌后減少質(zhì)量+貯存過程減少質(zhì)量。

（2）生長特性。①菌落總數(shù)。用無菌生理鹽水溶解稀釋菌株至每0.1 mL 含菌數(shù)為100～150 CFU，分別吸取菌懸液0.1 mL，均勻涂布接種于待測平板和參比平板。每一稀釋度接種兩個(gè)平板，置于（36±1）℃培養(yǎng)48 h，對菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。②生長率。生長率測試是GB 4789.28—2013 中培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制的測試方法。按規(guī)定用適當(dāng)方法將適量測試菌株的工作培養(yǎng)物接種至固體、半固體和液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基上菌株的生長率應(yīng)達(dá)到GB 4789.28—2013所規(guī)定的最低限值，生長率數(shù)值越大說明培養(yǎng)基越適合該種菌株的生長。PCA 培養(yǎng)基作為非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基，按GB 4789.28—2013 中非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的目標(biāo)菌（質(zhì)控菌株）生長率定量測試方法，PCA 培養(yǎng)基質(zhì)控菌株生長率（PR）=Ns/No，且應(yīng)不小于0.7。其中，Ns為待測PCA 培養(yǎng)基平板上質(zhì)控菌株菌落總數(shù)，CFU；No為參比（TSA）培養(yǎng)基平板上質(zhì)控菌株菌落總數(shù)，CFU，該菌落總數(shù)應(yīng)≥100 CFU。PCA 培養(yǎng)基質(zhì)控菌株生長率定量測試中所用的質(zhì)控菌株分別為大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基理化特性測定結(jié)果和分析

按照1.4.2（1）方法，每次滅菌后觀察培養(yǎng)基外觀變化，測定25 ℃時(shí)的pH 值并稱重，結(jié)果見表1。由表1可知，1 號、2 號、5 號PCA 培養(yǎng)基滅菌1 次后常溫保存3 d、4 ℃保存3 d、滅菌后現(xiàn)用對培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量、pH、外觀影響不大；由5 號、4 號、3 號可知，PCA 培養(yǎng)基隨著滅菌次數(shù)變多，滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量變小，pH 值下降，培養(yǎng)基顏色加深，但均一度不變，也未見渾濁。這主要由于高溫滅菌導(dǎo)致培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，質(zhì)量變少，同時(shí)培養(yǎng)基中少部分還原糖類與氨基酸化合物高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)[7-8]，生成有色物質(zhì)，影響培養(yǎng)基顏色，水分減少。此外，高溫可讓部分培養(yǎng)基成分發(fā)生變化，導(dǎo)致pH 下降但變化不大。

表1 PCA 培養(yǎng)基經(jīng)不同處理后的理化特性結(jié)果

2.2 培養(yǎng)基生長特性測定結(jié)果與分析

2.2.1 菌落總數(shù)

按照1.4.2（2）方法，用不同質(zhì)控菌株分別進(jìn)行菌落總數(shù)的測定，結(jié)果見圖1。

圖1 不同處理?xiàng)l件下PCA 培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的菌落總數(shù)

由圖1可知，3 株質(zhì)控菌株在5 種處理?xiàng)l件下的PCA 培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)存在差異，滅菌1 次后現(xiàn)用且未經(jīng)過保存3 d 處理?xiàng)l件下的PCA培養(yǎng)基上3 種質(zhì)控菌株的菌落總數(shù)均為最高。由5號、4 號、3 號可知，隨著PCA 培養(yǎng)基滅菌次數(shù)增加3 種質(zhì)控菌株的菌落總逐漸減少，滅菌3 次的PCA 培養(yǎng)基上質(zhì)控菌株的菌落總數(shù)最低；由1 號、2 號、5 號可知，相比滅菌1 次現(xiàn)用處理?xiàng)l件下的培養(yǎng)基，PCA 培養(yǎng)基滅菌1 次后常溫保存3 d 和4 ℃保存3 d 處理?xiàng)l件下的3 種質(zhì)控菌株的菌落總數(shù)減少。

2.2.2 生長率測定結(jié)果與分析

按GB 4789.28—2013 要求，PCA 培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的生長率PR≥0.7。由表2可知，3 種質(zhì)控菌株分別在經(jīng)5 種不同處理?xiàng)l件后的PCA 培養(yǎng)基上的生長率都能達(dá)到PR≥0.7 的要求。說明這些處理對PCA 培養(yǎng)基質(zhì)量影響較小，仍滿足培養(yǎng)基的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 不同處理?xiàng)l件下PCA 培養(yǎng)基的生長率結(jié)果

3 結(jié)論

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）是關(guān)于培養(yǎng)基質(zhì)量要求方面現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)。此標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了培養(yǎng)基的質(zhì)量應(yīng)符合的基本要求和微生物學(xué)要求。其中基本要求包括培養(yǎng)基外觀、色澤、均一性和pH 等方面；微生物要求指生長特性，包括生長率、選擇性兩方面。若培養(yǎng)基的基本要求和微生物學(xué)要求均符合規(guī)定，則該批培養(yǎng)基可被接受，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。

實(shí)驗(yàn)把食品微生物檢驗(yàn)中經(jīng)常使用的非選擇性培養(yǎng)基中的PCA 培養(yǎng)基當(dāng)作研究對象，改變滅菌后PCA 培養(yǎng)基的貯存條件或滅菌次數(shù)，按GB 4789.28—2013 對培養(yǎng)基質(zhì)量的要求，進(jìn)行了pH 值、色澤、均一度和質(zhì)量等理化性質(zhì)以及質(zhì)控菌株生長情況和生長率的測定。結(jié)果表明，PCA 培養(yǎng)基滅菌后在常溫保存3 d、4 ℃保存3 d、滅菌3 次的質(zhì)量都能符合GB 4789.28—2013 要求，滿足實(shí)驗(yàn)需求，不會影響培養(yǎng)基的性能，可能是由于PCA 培養(yǎng)基組成成分簡單、穩(wěn)定，滅菌后放置貯存再融化和重復(fù)滅菌不易破壞有效成分，且PCA 培養(yǎng)基為非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基，極其適合微生物生長，所以微生物對PCA培養(yǎng)基質(zhì)量要求降低。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用在實(shí)際工作中，可將實(shí)驗(yàn)剩余PCA 培養(yǎng)基放置于潔凈或無菌環(huán)境保存，短期內(nèi)可滅菌或直接融化后再次使用，便于節(jié)省PCA培養(yǎng)基。同時(shí)，若實(shí)驗(yàn)室預(yù)先配制并貯存PCA 培養(yǎng)基也能夠幫助解決因滅菌設(shè)備不足無法短期內(nèi)完成大批量檢驗(yàn)任務(wù)的問題，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)便利性。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，滅菌1 次現(xiàn)用的PCA 培養(yǎng)基最適合微生物生長，所以日常開展實(shí)驗(yàn)中仍盡可能采用這種方式處理培養(yǎng)基。但是，不是所有培養(yǎng)基經(jīng)過上述條件處理后都仍能滿足實(shí)驗(yàn)需要。不同培養(yǎng)基的組成成分不同，有些培養(yǎng)基組成成分復(fù)雜、不穩(wěn)定，不能重復(fù)滅菌，或者有些培養(yǎng)基的組成成分在貯存過程中容易自行降解，甚至不同廠家不同批次的同一培養(yǎng)基也存在成分或質(zhì)量差異，所以需要根據(jù)具體培養(yǎng)基的類別和性質(zhì)開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，才能確定貯存條件或滅菌次數(shù)對該培養(yǎng)基質(zhì)量的影響。此外，貯存培養(yǎng)基的環(huán)境應(yīng)盡量保持潔凈或無菌，貯存過程也應(yīng)進(jìn)行信息登記，才能保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。