李 龍

（龍口市檢驗檢測中心，山東龍口 265701）

我國是世界漁業(yè)大國與水產品進出口貿易強國，但每年仍不可避免地存在因水產品獸藥殘留問題導致的貿易糾紛，歸其原因主要是養(yǎng)殖密度過高、池塘的消毒處理不嚴格及反復使用以及環(huán)境污染等影響，導致水產養(yǎng)殖動物的病害嚴重。部分養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖經驗的缺乏，規(guī)避經濟風險的考慮，經常會濫用抗生素及超劑量使用獸藥，這些藥物降低了水生動物的發(fā)病率與死亡率，也引發(fā)了藥物的濫用、違禁使用等一系列問題[1]。其中，氯霉素類藥物作為一種低成本、高效、抗菌譜廣的抗生素被廣泛使用，氯霉素類藥物主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考（氟甲砜霉素），對于治療水產品的傳染性疾病均有顯著效果。其中，氯霉素因具有可導致人和動物的再生障礙性貧血、免疫抑制強的副作用，在農業(yè)農村部公告第250 號中已禁止使用。甲砜霉素的血液毒性雖然變弱，但仍具有較強的免疫抑制作用，且抗菌效果弱于氯霉素。氟苯尼考作為新型的氯霉素藥物，具有不易產生耐藥性、安全性高、抗菌活性強、體內吸收效果好以及生物利用率高等優(yōu)點。但因具有胚胎毒性，其在水產食品中的殘留檢測逐漸受到重視[2]。為了確保消費者的健康，歐盟、美國、中國等國家或組織已嚴格禁止在動物源食品中使用氯霉素藥物，并對氯霉素類藥物的最高殘留量作出了規(guī)定[3-6]。由于氯霉素類藥物在水產品中的殘留量很低，這就需要利用高靈敏度、低檢測限的檢測方法測定。色譜-質譜聯用技術具有分離能力強、分離效率高以及靈敏度高等優(yōu)點，適合低殘留組分的檢測。而UPLC-MS /MS 分析方法除了具有上述共性優(yōu)點，還具有分析時間短，能分析極性強、不易揮發(fā)和熱穩(wěn)定差的化合物，自動化程度高，能滿足大批量樣品檢測的能力。三重四極桿串聯質譜既可以對目標物定性又可以定量，不僅使結果更加準確，也解決了其他儀器檢測存在的假陽性與基質干擾的問題。HAMMACK 等[7]對氣相色譜法測定氯霉素殘留量的方法進行改進，選用液質聯用檢測技術進行檢測。結果表明，該方法具有更高的靈敏度。張靜等[8]利用高效液相色譜-ESI 串聯質譜法測定雞肉、雞蛋中的氯霉素類藥物殘留量，該方法前處理簡單，方法的定量限為0.1 μg·kg-1，滿足殘留檢測限量的要求，為本課題的研究提供了實驗基礎。

1 儀器與方法

1.1 材料、試劑與儀器

空白鯉魚市售（檢測后不含氯霉素類抗生素）。

乙腈（色譜純）；正己烷（色譜純）；標準物質氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（100 μg·mL-1單標，中國計量科學研究院）和氚代氯霉素（d5-CAP）（100 μg·mL-1，中國計量科學研究院）。

超高效液相色譜- 串聯質譜儀（Waters Xevo TSQ Micro）配ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國沃特斯公司）；超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；SFTGL-18R 離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；HSC-24B 氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 色譜條件與質譜條件

1.2.1 色譜條件

C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流動相：水（A）-乙腈（B）；流速：0.25 mL·min-1。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質譜條件

離子源：ESI 離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：MRM 多反應監(jiān)測；電噴霧電壓：-3 000 V；輔助氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：50 L·hr-1；霧化氣流速：800 L·hr-1；碰撞氣：氬氣。其他質譜參數見表2。

表2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的質譜條件

1.3 溶液的配制

分別準確量取濃度為100 μg·mL-1的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準物質各1 mL，用乙腈定容至10 mL，配成10 μg·mL-1的單標標準儲備溶液，再配成1 μg·mL-1的混合標準儲備溶液，于-18 ℃冰箱保存。根據工作液的需要，再以乙腈稀釋至適當濃度，現用現配。準確吸取適量氘代氯霉素標準溶液，用乙腈配成100 ng·mL-1的內標標準溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 試樣的制備

將市售的淡水魚去掉頭、骨及內臟，取肌肉、魚皮等可食部分約500 g，絞碎混合均勻后備用[9]。

1.4.2 提取

準確稱取試樣5 g（精確至0.01 g），置于50 mL聚四氟乙烯的離心管中，加入200 μL 的100 ng·mL-1氘代氯霉素內標標準溶液和25 mL 乙腈，渦旋混勻30 s，超聲提取30 min，8 000 r·min-1離心10 min，取5 mL 上清液于氮吹管內，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈-水溶液（V∶V=3∶7）溶解殘渣，渦旋混勻，加入5 mL正己烷液液萃取除脂，渦旋混勻，8 000 r·min-1離心10 min，去除正己烷層，取下層清液過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS 測定。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考均以氘代氯霉素為內標，內標法定量。

1.5 基質標準曲線的繪制

根據標準曲線的濃度范圍，準確吸取適量濃度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考混合標準工作液適量，添加40 μL 的100 ng·mL-1氘代氯霉素內標標準溶液混勻，用提取的陰性基質溶液定容至1 mL，配制成濃度為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的基質混合標準溶液，過0.22 μm 濾膜后，供液相色譜-質譜儀測定。基質標準曲線的縱坐標為定量離子峰面積與氘代氯霉素峰面積的比值，橫坐標為混合標準溶液中被測組分濃度與氘代氯霉素濃度的比值。

1.6 檢出限、定量限的測定

本實驗采用信噪比的方法來評估方法的檢出限與定量限，通過向空白基質樣品中添加目標組分的混合標準溶液，做6 個平行實驗，測定其信噪比，當目標組分的特征離子峰與基線噪音值的比值＞3 時為方法檢測限（LOD），信噪比＞10 為方法定量限（LOQ）。

1.7 準確度與精密度的測定

利用向陰性基質樣品添加目標組分進行添加回收實驗，采用3 個濃度的添加回收，使魚肉中氯霉素的實際添加量為0.1 μg·kg-1、0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1，甲砜霉素、氟苯尼考的實際添加量為1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1，每個濃度做6 個平行，按1.4進行樣品前處理，計算加標回收率。精密度是通過相對標準偏差的比值來評估的。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜的主要優(yōu)化條件為流動相的選擇與梯度洗脫程序的建立，考慮3 種目標組分的化學性質為弱極性的堿性化合物，并對乙腈、乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑有極強的溶解性。有機相比較了液相質譜儀常用的流動相甲醇與乙腈，實驗發(fā)現利用甲醇作流動相的分離效果比乙腈好，但是使用甲醇流動相時，柱壓相對較高，使用乙腈流動相時，3 種物質的峰形尖銳，響應信號高，滿足實驗的要求。水相比較了水、5 mmol·L-1乙酸銨溶液、0.1%甲酸水3 種流動相，水相的酸堿度對于3 種物質的分離效果影響不大，對質譜響應值也無明顯影響?？紤]乙酸銨溶液為鹽溶液，如果洗脫不干凈容易造成儀器的故障，綜合考慮選擇水-乙腈流動相進行分離。梯度洗脫程序先減少初始有機相比例，避免因初始有機相比例過高出現極性峰，根據目標組分極易溶于有機相中，故目標化合物會隨著流動相中有機相比例的增加先流出，再降低流動相中有機相的比例，色譜柱中殘存的干擾雜質被洗脫，梯度洗脫程序既能提高分離能力又能減少雜質的干擾。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

由于氯霉素類物質電負性較強，故采用負離子掃描模式，該掃描模式下得到的準分子離子峰m/z320.9[M-H]–單一，可避免樣品中的基質帶來的干擾，響應信號高，色譜峰的峰形也好[10]。利用直接從質譜進樣的方式，先對3 種目標組分進行一級質譜MS Scan，確定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的母離子分別為m/z320.9、353.9、355.9，并確定各自的錐孔電壓。然后固定上述母離子及錐孔電壓，進行子離子掃描，在此質譜條件下，氯霉素主要產生m/z257.0，151.9等子離子；甲砜霉素主要產生m/z289.9、226.9、184.9等子離子；氟苯尼考主要產生m/z118.9、184.9、335.9等子離子。選擇豐度最強的m/z257.0，151.9 作為氯霉素定性、定量離子；m/z289.9 和184.9 作為甲砜霉素的監(jiān)測離子；m/z335.9 和184.9 作為氟苯尼考的監(jiān)測離子。在上述監(jiān)測離子中選用相對離子豐度強的子離子作為定量離子，并對各子離子的碰撞能量進行優(yōu)化，最終確定多反應監(jiān)測的條件如表2所示。

2.3 方法的線性范圍、檢出限

本研究發(fā)現，在0.1～10.0 ng·mL-1，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的定量離子峰面積與氘代氯霉素峰面積的比值與目標組分濃度與氘代氯霉素內標濃度的比值均呈良好的線性關系，相關系數均大于0.990，見表3。當3種組分的添加濃度水平為0.1 μg·kg-1時，平均信噪比分別為4.2、4.4、5.7，均大于3，證實本方法氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的檢出限均為0.1 μg·kg-1。

表3 標準曲線相關參數

2.4 準確度和精密度

由表4可知，回收率實驗滿足化學分析方法確認中對方法回收率偏差范圍的規(guī)定，即當添加濃度小于0.1 mg·kg-1時，回收率為60%～120%[11]。平行實驗的相對標準偏差均小于20%，表明結果重復性好，精密度高。

表4 回收率及精密度測定結果

3 結論

本研究先利用質譜調諧確定各目標組分的質譜參數，再篩選高分離效果的色譜條件，不斷簡化、優(yōu)化樣品前處理步驟，建立了UPLC-MS/MS 快速測定水產品中氯霉素類藥物殘留的分析方法，通過系列驗證實驗證明該方法的靈敏度、準確度均能滿足低殘留限量氯霉素類藥物分析的要求。本方法同時具有有機溶劑消耗少，實驗周期短等優(yōu)點，能同時滿足對氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考3 種藥物的多殘留檢測。