王存孝

（南京科技職業(yè)學院，江蘇南京 210048）

香料是日常食品中一類可以改變食品味道的物質，如香蘭素（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）就是目前市場上重要的香料之一，它具有濃郁的奶香氣息，能起到增香、抑菌和抗氧作用[1]，被廣泛用于食品特別是乳制品中。香蘭素的過量使用會對人體產生危害，導致惡心、嘔吐和頭痛等癥狀，嚴重時甚至會損傷肝腎功能[2]?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2790—2014）規(guī)定了香蘭素在食品中的使用限量[3]，而現(xiàn)在許多乳品企業(yè)為了滿足消費者口味，在奶粉中過量使用香蘭素和香精等添加劑，危害到消費者尤其是兒童的健康。

較為常見的香蘭素的檢測方法有色譜法、光譜法和電化學方法等[3]。采用紫外-可見分光光度法測定香蘭素，操作簡便、分析成本低、結果可靠，然而靈敏度較低，易受其他組分的譜線干擾[4]。電化學方法響應迅速、靈敏度高，但樣品基質干擾嚴重，存在重復性差的問題。氣相色譜法在檢測時，由于前處理時間長、預處理復雜，易使香蘭素氧化變質，不適用于現(xiàn)場快速檢測。液相色譜-質譜法儀器昂貴，檢測成本高，對環(huán)境和人的要求也高，在基層檢驗機構中推廣困難[5]。高效液相色譜法則因其精密度、靈敏度高，操作相對簡單快速而被廣泛地應用。本文旨在采用高效液相色譜法建立一種針對市售常見奶粉中香蘭素的快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Waters 2695 色譜儀；HY-2 漩渦振蕩器（上海雷磁有限公司）；JP-3 超聲波清洗器（上海繼譜有限公司）；TG16 離心機（湖南湘儀）；0.45 μm 微孔濾膜。

1.1.2 試劑

香蘭素標準溶液（≥98%）(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇（色譜級）；乙醇（AR）；奶粉樣品（6 份，1～3 號為普通奶粉，4～6 號為幼兒奶粉）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

標準儲備溶液（5 mg·mL-1）：稱取1.25 g（準確到0.000 1 g）香蘭素到250 mL 容量瓶中，使用乙醇溶解并定容搖勻，4 ℃避光保存。

標準中間溶液（100 μg·mL-1）：從標準儲備溶液中移取2.00 mL 至100 mL 容量瓶中，使用乙醇稀釋至刻度線，4 ℃避光保存。

標準工作溶液：移取一系列適量的100 μg·mL-1溶液，使用相同的稀釋方法配制成含有0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1香蘭素的標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

奶粉試樣攪拌均勻后，準確稱取2 g 于試管中，加入25 mL 的常溫水，超聲振動10 min，混勻并溶解，再將其旋渦振蕩40 s。

移取以上試樣溶液10.00 mL 于離心管中，加入10 mL 乙醇，渦旋混合40 s，然后高速離心8 min，用滴管將上層清液收集于容量瓶（50 mL）中。繼續(xù)往離心管中加入同樣體積的乙醇，重復此步驟操作2 次，每次都收集上層清液于同一個容量瓶中，將容量瓶定容至刻度線，搖勻，通過0.45 μm 微孔膜過濾，得到待測溶液。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：279 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

通過對標準液進行200～380 nm 的光譜掃描（圖1）可以發(fā)現(xiàn)，香蘭素的吸收峰有233 nm、279 nm 和308 nm 這3 處。233 nm 處峰型和靈敏度雖然較好，但易出現(xiàn)其他有機化合物的吸收峰干擾。選擇279 nm和308 nm 為檢測波長對香蘭素標準工作液測定發(fā)現(xiàn)，相對于308 nm 波長，279 nm 處目標峰峰形對稱性更好，信噪比更高。因此，選擇279 nm 作為檢測波長。

圖1 香蘭素的吸收光譜圖

2.2 前處理條件優(yōu)化

以1 號奶粉樣品為基準，通過測定香蘭素加標回收率的方法，考察提取劑對提取效率的影響。試驗結果表明，傳統(tǒng)的鹽酸和乙腈溶液雖然能沉淀完全蛋白質，去除脂肪干擾，但提取效率較低，回收率不到85%。當選擇乙醇作為提取劑后，提取效率提高10%以上。因此，本次實驗將采用乙醇來提取樣品中的香蘭素。

實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇的用量較少時（≤10 mL）時，樣品上層清液中會有蛋白和脂肪殘留，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，而當使用量增加至20 mL、30 mL、40 mL 時，提取率隨之升高?？紤]到30 mL和40 mL的提取效果接近，確定最終提取劑用量為30 mL。同時試驗發(fā)現(xiàn)，提取劑采用多次提取的方式效率更高，但當提取次數(shù)為3次以上時，效率反而轉低，可能是步驟和時間的增加導致待測物損失。因此，確定乙醇提取次數(shù)為3 次，每次10 mL。

渦旋混合時間過長會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，過短會導致提取率下降，混合時間在30～60 s 時，提取率比較穩(wěn)定。從節(jié)約處理時間的角度出發(fā)，選擇渦旋時間為30 s。

2.3 流動相的選擇

以甲醇水溶液（30%～40%）為流動相時，在分離度和靈敏度方面都能滿足測定需要。在樣品測定中發(fā)現(xiàn)，甲醇溶液的濃度對香蘭素的分離度影響不大，但會改變其出峰的時間。當甲醇濃度為30%時，待測組分和其他干擾組分即可實現(xiàn)良好的分離。因此，從成本和環(huán)保角度考慮，選擇30%的甲醇水溶液為流動相。

2.4 線性范圍和檢出限

對香蘭素標準工作溶液進行測定，繪制標準曲線，可得到圖2。在0.1～40.0 μg·mL-1，峰面積與濃度擁有良好的線性關系，其線性方程為y=79.398x+12.764，r2=0.999 7，檢出限（3S/N）為0.05 μg·mL-1。

圖2 香蘭素的標準曲線圖

2.5 回收率及精密度實驗

稱取1 號乳粉樣品20 份，每份2 g，按表1方法添加標樣，進行回收率實驗（n=5）。結果顯示，加標回收率為96.0%～100.2%，相對標準偏差小于5%。

表1 奶粉中香蘭素測定的回收率和RSD 表

2.6 實際樣品測定

對6 種樣品進行了香蘭素含量測定，平行測定5次，結果如表2所示。1～3 號普通奶粉能檢測出微量香蘭素，在幼兒奶粉中未測出香蘭素的存在，以上奶粉符合《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》要求。

表2 奶粉中香蘭素的檢測結果（n=5）

3 結論

香蘭素在空氣中易氧化和遇光分解的特性會給檢測帶來一定難度[6]。本研究結合香蘭素回收率試驗，優(yōu)化了樣品提取條件，并以甲醇水溶液為流動相，建立了一種高效液相色譜法測定奶粉中香蘭素的快速檢測方法。該方法在0.1～40.0 μg·mL-1線性關系良好，加標回收率和精密度均能滿足實際檢測的要求，可為奶粉中香蘭素的質量監(jiān)測提供重要參考依據(jù)。