理永霞，王璇，劉振凱，張星耀

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所，國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病(pine wilt disease，PWD)又稱松樹萎蔫病、松樹枯萎病，是我國(guó)目前危害最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一。 該病自1982 年在我國(guó)首次報(bào)道后[1]，在我國(guó)熱帶和亞熱帶地域迅速蔓延，近年來(lái)又逐步入侵暖溫帶，突破年均溫10 ℃線擴(kuò)張至遼寧等中溫帶和秦嶺等高海拔地域，引起大面積松林枯死，造成了巨大的林業(yè)經(jīng)濟(jì)與生態(tài)損失[2]。 另外，基于松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus的起源、極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性、寄主植物的廣泛分布、媒介昆蟲的廣泛存在及經(jīng)濟(jì)物流等活動(dòng)的高速發(fā)展等因素分析，我國(guó)松材線蟲病新發(fā)生和未發(fā)生地區(qū)如遼寧、吉林和內(nèi)蒙古等面臨松材線蟲入侵?jǐn)U張的高風(fēng)險(xiǎn)[3]。 鑒于當(dāng)前松材線蟲病危害現(xiàn)狀和入侵?jǐn)U張的嚴(yán)峻形勢(shì)，亟待提出該病有效防控策略。

松材線蟲致病機(jī)理是該病有效防控策略產(chǎn)出的理論基礎(chǔ)，也是松材線蟲病研究的核心內(nèi)容。 關(guān)于松材線蟲致病機(jī)理存在酶學(xué)說(shuō)、毒素學(xué)說(shuō)和空洞化學(xué)說(shuō)3 種觀點(diǎn)。 酶學(xué)說(shuō)認(rèn)為松材線蟲會(huì)分泌細(xì)胞壁降解酶破壞寄主細(xì)胞壁進(jìn)而引起植物枯萎死亡[4－5]；毒素學(xué)說(shuō)認(rèn)為松材線蟲及其伴生細(xì)菌[6]會(huì)分泌或誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生有毒物質(zhì)引起寄主發(fā)生病變死亡[7－9]；而空洞化學(xué)說(shuō)認(rèn)為，松材線蟲入侵后，誘導(dǎo)寄主體內(nèi)萜烯類物質(zhì)含量急劇增加，這些物質(zhì)具有強(qiáng)烈揮發(fā)性和疏水性，滲漏到松樹管胞后切斷管胞內(nèi)水分運(yùn)輸，最終導(dǎo)致松樹因缺水而死亡[10－12]。 3種學(xué)說(shuō)分別從生理生化以及組織病理學(xué)角度揭示了松材線蟲致病機(jī)理。 近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的推廣普及，基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組以及RNA測(cè)序等廣泛用于松材線蟲致病基因篩選，關(guān)于松材線蟲致病機(jī)理的研究取得了較好研究進(jìn)展。

松材線蟲病是由松材線蟲、寄主植物、媒介昆蟲、伴生細(xì)菌和真菌組成的復(fù)雜病害系統(tǒng)，同時(shí)又受環(huán)境因子及人類經(jīng)濟(jì)物流活動(dòng)等多種因素影響。 其中，松材線蟲為主要病原，由媒介昆蟲傳播接種到寄主松樹后，誘導(dǎo)寄主松樹枯萎死亡。 除了病原松材線蟲與寄主松樹之間的互作之外，松材線蟲伴生微生物以及松樹內(nèi)棲微生物作為病害系統(tǒng)中的重要組成部分，在病害發(fā)生過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。

基于松材線蟲病病害發(fā)生過(guò)程，結(jié)合最新研究相關(guān)熱點(diǎn)，筆者對(duì)最近幾年關(guān)于松材線蟲致病機(jī)理以及松材線蟲伴生微生物和松樹內(nèi)棲微生物在致病過(guò)程中的作用進(jìn)行回顧總結(jié)分析，梳理制約有效防控技術(shù)產(chǎn)出的瓶頸問(wèn)題，以明確下一步研究方向和內(nèi)容。

1 松材線蟲在致病過(guò)程中對(duì)寄主的作用

松材線蟲致病過(guò)程是松材線蟲致病性與寄主松樹抗性博弈的過(guò)程。 在這過(guò)程中，松材線蟲克服了寄主抗性，成功在樹體內(nèi)定殖擴(kuò)散，最終導(dǎo)致寄主枯萎死亡。 因此，松材線蟲致病機(jī)理研究的核心內(nèi)容是研究松材線蟲如何克服寄主防御反應(yīng)，如何導(dǎo)致寄主枯萎死亡等科學(xué)問(wèn)題。 總結(jié)最新相關(guān)研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，松材線蟲克服了寄主植物細(xì)胞壁等物理防御以及活性氧和萜烯類物質(zhì)等化學(xué)防御，同時(shí)通過(guò)功能因子干擾寄主防御最后導(dǎo)致寄主枯萎死亡。

1.1 松材線蟲分泌細(xì)胞壁降解酶克服寄主物理屏障

寄主松樹細(xì)胞壁是松材線蟲入侵和取食的主要障礙。 松材線蟲入侵時(shí)，寄主松樹木質(zhì)素等次生細(xì)胞壁相關(guān)物質(zhì)合成酶基因上調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)寄主細(xì)胞壁增厚，限制松材線蟲入侵[13－14]。 因此，為了成功入侵，松材線蟲分泌細(xì)胞壁降解酶破壞植物細(xì)胞壁，克服寄主物理屏障[15]。 松材線蟲分泌的細(xì)胞壁降解酶主要包括纖維素酶(cellulase)、糖基水解酶(glycosyl hydrolase)、果膠裂解酶(pectate lyases)、擴(kuò)展蛋白(expansin)、α－L－糖苷酶(α－L－glycosidase)等[4]。

纖維素酶具有纖維素和半纖維素酶活性，通過(guò)食道腺上皮細(xì)胞和口針?lè)置诘郊闹黧w內(nèi)后，作用于植物細(xì)胞壁纖維素－半纖維素復(fù)合物，降解寄主細(xì)胞壁，因此被認(rèn)為是松材線蟲降解植物細(xì)胞壁的關(guān)鍵酶[16－18]。 RNA 干擾(RNAi)沉默松材線蟲纖維素酶基因后，松材線蟲在寄主體內(nèi)的遷移速率降低，致病力減弱[19－20]。 纖維素酶不僅能降解植物細(xì)胞壁的纖維素，使松材線蟲在早期寄生過(guò)程中能順利侵入寄主體內(nèi)而成功定殖，而且在病害后期松材線蟲腐生取食真菌階段也有重要作用[19]。 因此，纖維素酶在松材線蟲致病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

糖基水解酶是松材線蟲主要細(xì)胞壁降解酶之一[21]。 松材線蟲擁有多個(gè)糖基水解酶基因，可能是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從真菌中獲得的[21－23]。 松材線蟲糖基水解酶在松材線蟲基因組中具有多個(gè)拷貝和串聯(lián)重復(fù)序列，拷貝數(shù)與松材線蟲致病性有關(guān)，串聯(lián)重復(fù)序列的差異可導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列的變化，從而也會(huì)影響其致病性。 因此，松材線蟲特異性糖基水解酶基因通過(guò)拷貝序列和串聯(lián)重復(fù)序列的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)其基因功能，從而在松材線蟲寄生過(guò)程中發(fā)揮不同作用[24]。 糖基水解酶家族30(Bx －GH30)基因在高致病性的松材線蟲中大量表達(dá)，并且可以引起模式植物本氏煙Nicotiana benthamiana細(xì)胞程序化死亡，從而在松材線蟲致病過(guò)程中發(fā)揮著作用[25]。

果膠裂解酶在松材線蟲致病過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。 Kikuchi 等[26]克隆了松材線蟲果膠裂解酶基因(Bx－pel1)，該基因具有多聚半乳糖醛酸活性，在松材線蟲致病過(guò)程中大量表達(dá)[27]，在食道腺中特異表達(dá)后通過(guò)口針?lè)置诘郊闹骷?xì)胞中，有助于松材線蟲在樹體內(nèi)取食和遷移。 RNAi 沉默該基因后，松材線蟲在樹體內(nèi)繁殖率和遷移率降低，致病性也降低[28]。 果膠裂解酶基因(Bx －pel3)也在食道腺中特異表達(dá)，可以通過(guò)口針?lè)置诘郊闹骷?xì)胞中，降解植物細(xì)胞壁，在松材線蟲致病過(guò)程中發(fā)揮作用[29]。

松材線蟲擴(kuò)張蛋白酶基因在與寄主互作過(guò)程中大量上調(diào)表達(dá)[30]，在側(cè)腹腺細(xì)胞中特異表達(dá)后，可以通過(guò)口針?lè)置诘郊闹骷?xì)胞中，參與松材線蟲致病過(guò)程[31]。 完整降解植物細(xì)胞壁中的木葡聚糖，必須釋放葡聚糖主干上的取代基，α－L－糖苷酶可裂解木葡聚糖分支中的L－糖苷殘基，在植物細(xì)胞壁降解中也發(fā)揮了重要作用[32]。

總之，松材線蟲入侵時(shí)通過(guò)分泌大量細(xì)胞壁降解酶，降解寄主松樹細(xì)胞壁，克服寄主物理障礙，為松材線蟲在樹體內(nèi)遷移、取食和繁殖奠定基礎(chǔ)，從而在松材線蟲的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 但松材線蟲細(xì)胞壁降解酶在致病過(guò)程中作用的分子機(jī)理還需更直接的證據(jù)和深入研究。

1.2 松材線蟲通過(guò)解毒基因消除寄主化學(xué)防御

松材線蟲入侵后，寄主會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧以及萜烯類物質(zhì)等化學(xué)防御物質(zhì)[33－35]抵抗或抑制松材線蟲的入侵。 活性氧可使酶失活、蛋白質(zhì)氧化、DNA 損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)變性等，破壞細(xì)胞功能和完整性，對(duì)松材線蟲具有強(qiáng)烈的毒害作用[36]；萜烯類物質(zhì)會(huì)影響松材線蟲繁殖率和致病性[37－39]。 為了能在寄主體內(nèi)成功定殖，松材線蟲必須通過(guò)解毒作用，降解或消除寄主的這些化學(xué)防御產(chǎn)物，因此，松材線蟲致病過(guò)程中大量解毒基因上調(diào)表達(dá)，這些解毒基因主要包括活性氧清除相關(guān)基因以及萜烯類物質(zhì)解毒途徑相關(guān)基因。

關(guān)于活性氧的清除，松材線蟲進(jìn)化出了多層抗氧化策略來(lái)保護(hù)自身免受寄主活性氧的毒害[40]。在與寄主互作過(guò)程中，松材線蟲過(guò)氧化物酶(peroxidase，PRXs)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPXs)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SODs)等大量表達(dá)[30，41]。 其中SODs 可催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和氧氣[42]，PRXs 和GPXs 等可以將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O[43]。 松材線蟲過(guò)氧化物酶基因BxPrx在松材線蟲不同組織中大量表達(dá)并分泌到線蟲體外，松材線蟲侵染寄主后，其過(guò)氧化物酶基因BxPrx響應(yīng)寄主H2O2積累而上調(diào)表達(dá)，體外H2O2處理后，BxPrx基因也顯著上調(diào)表達(dá)[33－44]，BxPrx體外重組蛋白對(duì)H2O2具有較高的抗氧化活性。 通過(guò)RNAi 技術(shù)沉默BxPrx基因后，松材線蟲繁殖率和致病性降低[45]。 另外，BxPrx在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans中超表達(dá)后，秀麗隱桿線蟲的抗氧化性增強(qiáng)[46]。BxPrx可能通過(guò)降低寄主環(huán)境中H2O2含量，提高松材線蟲對(duì)活性氧的適應(yīng)性，從而適應(yīng)寄主高濃度活性氧環(huán)境[47]。

松材線蟲自噬基因可能在松材線蟲抵御寄主活性氧毒害中也發(fā)揮了重要作用。 松材線蟲自噬基因BxATG5、BxATG9和BxATG16在與寄主互作早期均有上調(diào)表達(dá)；過(guò)氧化氫處理?xiàng)l件下BxATG5、BxATG9和BxATG16均上調(diào)表達(dá)，通過(guò)3 －甲基腺嘌呤抑制自噬基因表達(dá)或沉默BxATG9和BxATG16后，松材線蟲在過(guò)氧化氫處理?xiàng)l件下的取食、繁殖、卵孵化和活性均受到抑制，同時(shí)對(duì)寄主的致病性也降低；另外，松材線蟲自噬基因可能與過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶之間有協(xié)同作用，松材線蟲自噬基因被抑制時(shí)，過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性會(huì)增強(qiáng)[48]。 因此，松材線蟲進(jìn)化出多種策略應(yīng)對(duì)寄主活性氧的損傷。

松材線蟲活性氧耐受性與致病性有關(guān)，致病性越強(qiáng)的松材線蟲蟲株，對(duì)活性氧耐受性越強(qiáng)；對(duì)活性氧的耐受性可能還與角質(zhì)層厚度等物理因素有關(guān)。致病性高的P9 株系在過(guò)氧化氫(H2O2)脅迫條件下的存活率高于致病性低的P3 株系，在松樹苗上繁殖率也更高；致病性更高的蟲株，其角質(zhì)層更厚[49]。松材線蟲對(duì)活性氧的耐受性在致病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但其作用機(jī)制還需要深入研究。

為了應(yīng)對(duì)松樹萜烯類物質(zhì)的抑制作用，松材線蟲通過(guò)解毒作用對(duì)其進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，降低其毒害作用，從而保證取食和遷移等整個(gè)病理學(xué)過(guò)程順利進(jìn)行[50－52]。 松材線蟲的解毒作用可能分為3 個(gè)不同階段:首先通過(guò)細(xì)胞色素P450 氧化還原作用給次生代謝產(chǎn)物加上功能團(tuán)，使其更適合作為下游反應(yīng)的底物；然后通過(guò)黃素單氧酶(FMO)、糖基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸氧化酶、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、酸性磷酸酶、環(huán)氧化物酶等將有毒代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)[38－39]；最后通過(guò)ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)酶等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到線蟲體外[52]。 在α－蒎烯和β－ 蒎烯脅迫條件下，松材線蟲細(xì)胞色素P450、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、ATP 結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)酶等相關(guān)解讀基因大量上調(diào)表達(dá)[38－39]。 松材線蟲細(xì)胞色素P450 代謝途徑是松材線蟲外源物質(zhì)和毒素代謝的主要途徑，在致病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[27，53]。CYP33C9、CYP33C4基因響 應(yīng) 寄主α－蒎烯和β－蒎烯積累而大量表達(dá)，與寄主萜烯物質(zhì)代謝存在明顯的相關(guān)性，RNAi 沉默CYP33C9、CYP33C4、CYP33D3基因后，松材線蟲活性、遷移率、繁殖率、致病性降低[54－55]。

綜上所述，松材線蟲無(wú)論是對(duì)松樹活性氧的清除，還是對(duì)萜烯代謝的降解或利用，更多的還是現(xiàn)象和推測(cè)，這些不同解毒基因的作用機(jī)制及其相互作用還需要進(jìn)一步研究。

1.3 松材線蟲通過(guò)功能因子調(diào)節(jié)寄主防御反應(yīng)

松材線蟲與寄主互作過(guò)程中，分泌功能因子調(diào)節(jié)寄主防御反應(yīng)，誘導(dǎo)寄主防御產(chǎn)物大量積累，最終導(dǎo)致寄主過(guò)度防御而死亡。 松材線蟲功能因子主要包括毒液過(guò)敏原蛋白(venom allergen proteins，VAPs)、類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine protease inhibitors，CPIs)以及其他可與寄主互作的功能因子。

線蟲類毒液過(guò)敏源蛋白可能參與了其與寄主互作過(guò)程中胞間蛋白酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)寄主防御反應(yīng)[40]。 胞間蛋白酶信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以調(diào)節(jié)植物對(duì)病原物局部和系統(tǒng)防御，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)通過(guò)底物的蛋白水解過(guò)程傳導(dǎo)信號(hào)激活下游反應(yīng)[56]。 馬鈴薯胞囊線蟲Globodera rostochiensis分泌類毒液過(guò)敏源蛋白，特異性抑制番茄類木瓜酵素半胱氨酸蛋白酶(papain-like Cys protease)Rcr3[57]，該抑制作用能誘導(dǎo)寄主防御相關(guān)基因的顯著變化[58]，抑制植物免疫反應(yīng)[59]。 線蟲寄生過(guò)程中分泌類毒液過(guò)敏源蛋白的同時(shí)，還會(huì)分泌大量的細(xì)胞壁降解酶，類毒液過(guò)敏源蛋白可能參與調(diào)解細(xì)胞壁降解反應(yīng)引發(fā)的防御反應(yīng)[40]。 松材線蟲類毒液過(guò)敏源蛋白(Bx －VAP1) 屬于食道腺分泌蛋白，與松材線蟲致病性緊密相關(guān)[60]。 松材線蟲與海岸松Pinus pinaster互作過(guò)程中Bx－VAP1和Bx－VAP2大量表達(dá)[30]，RNAi沉默Bx－VAP1基因后，松材線蟲在寄主體內(nèi)的遷移率和致病力降低。Bx －VAP1基因體外重組表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)馬尾松P.massoniana的α－蒎烯合成酶基因表達(dá)上調(diào)，α－蒎烯大量積累；寄主松樹細(xì)胞質(zhì)壁分離，細(xì)胞核降解，接種點(diǎn)附近部位出現(xiàn)細(xì)胞程序化死亡[61]。 因此，松材線蟲Bx －VAP1基因可能具有調(diào)節(jié)寄主防御反應(yīng)的作用，但具體如何調(diào)節(jié)還缺少直接的證據(jù)。

松材線蟲類甜蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制劑可能通過(guò)模擬作用干擾寄主防御反應(yīng)。 植物寄生線蟲與寄主互作過(guò)程中，線蟲會(huì)分泌模擬因子干擾植物信號(hào)通路，調(diào)解植物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程。 植物寄生線蟲分泌線蟲CLE(CLAVATA3/ESR-like)肽鏈，與植物CLE 肽鏈具有高同源性，干擾寄主細(xì)胞增殖與分化過(guò)程，使寄主持續(xù)產(chǎn)生巨細(xì)胞，不斷為寄生線蟲提供食物[62]。 松材線蟲分泌蛋白質(zhì)組分析研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲2 條類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)和1 條類半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine protease inhibitors，CPIs)與寄主植物來(lái)源的蛋白同源性更高[63]。 單獨(dú)克隆分析松材線蟲Bx －TLP1、Bx－TLP2和Bx －CPI后，與動(dòng)物源的蛋白相比，這3 條蛋白均與植物源蛋白同源性更高[64－65]。 接種松材線蟲后，馬尾松類甜蛋白基因(Pm－TLP) 與松材線蟲類甜蛋白Bx－TLP1基因相對(duì)表達(dá)量存在此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。 因此，松材線蟲Bx －TLP1基因可能模擬馬尾松Pm－TLP基因的表達(dá)，進(jìn)而影響松樹萜烯物質(zhì)含量[66]。 另外，Bx － TLP1、Bx － TLP2和Bx－CPI能誘導(dǎo)本氏煙細(xì)胞程序化死亡，松材線蟲Bx－TLP1、Bx－TLP2和Bx －CPI可能通過(guò)分子模擬作用誘導(dǎo)寄主植物的過(guò)敏反應(yīng)[67]，但這些基因是否模擬和如何模擬還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

松材 線 蟲 VAP、 TLP、 CPI 等 功 能 因 子 受STATAWAARS 啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控。 Espada 等發(fā)現(xiàn)了松材線蟲新的啟動(dòng)子(STATAWAARS)[68]。 該啟動(dòng)子序列是松材線蟲597 個(gè)基因的上游編碼區(qū)域，約300 bp，大多數(shù)含有STATAWAARS 的啟動(dòng)子有一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)域，包含6 個(gè)元件的2 個(gè)激活子。該序列在松材線蟲食道腺特異表達(dá)，與食道腺基因表達(dá)有關(guān)。 松材線蟲食道腺大量表達(dá)的細(xì)胞壁降解酶(纖維素酶、β－1，3 －內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酸裂解酶、擴(kuò)張蛋白等)、VAP 蛋白、TLP 蛋白以及CPI 蛋白酶等與STATAWAARS 的啟動(dòng)子有關(guān)[68]。

松材線蟲還會(huì)分泌其他功能因子調(diào)控寄主防御反應(yīng)。 松材線蟲與黑松P.thunbergii互作過(guò)程中，松材線蟲鞘脂類激活蛋白(sphingolipid activating proteins)基因BxSapB1在松材線蟲側(cè)腹腺中大量表達(dá)后，編碼蛋白分泌到寄主組織中會(huì)影響寄主PR蛋白表達(dá)，可誘導(dǎo)本氏煙的細(xì)胞程序化死亡。 該基因沉默后寄主病程相關(guān)蛋白基因(PtPR － 1b，PtPR－3，PtPR －5)表達(dá)量降低且癥狀發(fā)生延遲。因此，該基因可能通過(guò)誘導(dǎo)寄主系統(tǒng)抗性在致病過(guò)程發(fā)揮重要作用[69]。 松材線蟲BxSCD5基因也可抑制本氏煙中病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)觸發(fā)的細(xì)胞死亡[15]，但沒(méi)有更深入的研究。

為了在寄主體內(nèi)成功定殖，松材線蟲首先分泌大量細(xì)胞壁降解酶，破壞寄主物理防御；同時(shí)，通過(guò)分泌抗氧化酶和降解酶，消除植物H2O2或降解轉(zhuǎn)化萜烯類物質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)的毒害作用，保證線蟲能在樹體內(nèi)成功取食、遷移、繁殖。 線蟲分泌不同功能因子影響寄主次級(jí)防御反應(yīng)，進(jìn)而引起寄主過(guò)度防御而死亡，但這些蛋白基因的具體功能及如何降解轉(zhuǎn)化或調(diào)節(jié)寄主的防御反應(yīng)都還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

2 松材線蟲伴生微生物在致病過(guò)程中的作用

2.1 產(chǎn)生植物毒素

松材線蟲伴生微生物可產(chǎn)生植物毒素，間接影響松材線蟲的致病過(guò)程。 從感病松樹中分離的24株微生物中有17 株可以產(chǎn)生植物毒素，這些會(huì)產(chǎn)生植物毒素的微生物大多數(shù)被鑒定為假單胞菌[70]。熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens分泌的毒素是環(huán)二肽即鞭毛蛋白相似的肽鏈，對(duì)黑松樹苗和細(xì)胞懸浮液均有毒性[71]。 該物質(zhì)能促進(jìn)松材線蟲及其相關(guān)微生物繁殖，與未處理的黑松愈傷組織相比，鞭毛蛋白肽鏈處理后死亡的黑松愈傷組織更多，且愈傷組織中松材線蟲和熒光假單胞菌數(shù)量更多[72]。單獨(dú)用無(wú)菌松材線蟲或擬松材線蟲接種，均不能使黑松愈傷組織褐變和無(wú)菌黑松苗枯萎，而用無(wú)菌線蟲與松材線蟲攜帶的3 種細(xì)菌分別混合接種均能使黑松無(wú)菌苗及愈傷組織嚴(yán)重發(fā)?。槐砻髟趯?shí)驗(yàn)室條件下，人工接種幼苗病害的發(fā)生與松材線蟲攜帶的細(xì)菌密切相關(guān)，而與線蟲的種類關(guān)系不大[73]。 另外，分離自松材線蟲的蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusHY－3 菌株能產(chǎn)生苯乙酸，促進(jìn)黑松體內(nèi)大量合成苯甲酸及其共軛物，誘導(dǎo)寄主死亡[74－75]。 松材線蟲攜帶的樹木伯克氏菌Burkholderia arborisKRICT1菌株會(huì)產(chǎn)生綠膿菌素，對(duì)赤松P.densiflora苗和愈傷組織都具有毒性，與芽孢桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的苯乙酸相比，綠膿菌素毒性更強(qiáng)[6]。 分析35 株松材線蟲伴生細(xì)菌對(duì)1 a 生海岸松的致病性發(fā)現(xiàn)，沙雷氏菌(Serratiasp. LCN －4、PWN －146)、腸桿菌(Enterobactersp. LCN － 25)、泛菌(Pantoeasp. PWN －128)能引起1 a 生海岸松針葉枯萎變黃[76]。 但這些研究都是在寄主愈傷組織或小苗上進(jìn)行，其作用機(jī)制及其在田間大樹上的結(jié)果具體如何還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 截至目前，只是驗(yàn)證了少量的松材線蟲伴生微生物具有產(chǎn)生毒素的作用，不足以完整說(shuō)明松材線蟲伴生微生物的致病作用[23]。 另外，接種無(wú)菌松材線蟲或非無(wú)菌松材線蟲后，無(wú)菌的赤松微扦插苗和馬尾松實(shí)生苗產(chǎn)生萎蔫癥狀，而接種從松材線蟲分離的細(xì)菌菌株后，赤松微扦插苗不枯萎；表明PWN 無(wú)菌并沒(méi)有導(dǎo)致致病性的喪失[77]。 因此，松材線蟲伴生微生物在松材線蟲致病過(guò)程中的作用，還需要根據(jù)不同菌株、不同樹種及不同立地環(huán)境具體問(wèn)題具體分析。

2.2 分解植物化學(xué)防御物質(zhì)

松材線蟲伴生微生物可分解植物化學(xué)防御物質(zhì)，消除寄主防御產(chǎn)物對(duì)松材線蟲的抑制作用，從而有助于松材線蟲致病作用。 松材線蟲伴生微生物沙雷氏菌Serratiaspp. 、假單胞菌Pseudomonassp. 和窄食單胞菌Stenotrophomonassp. 等具有活性氧和萜烯降解活性，有助于松材線蟲在樹體內(nèi)大量繁殖。松材線蟲伴生沙雷氏菌對(duì)活性氧具有極強(qiáng)的抗性，可促進(jìn)松材線蟲在強(qiáng)活性氧逆境條件下繁殖，并且會(huì)影響松材線蟲過(guò)氧化氫酶基因(Bxy－ctl－1和Bxyctl －2)的表達(dá)[78－79]。 假單胞菌P.yamanorum和P.extremaustralis的基因組中存在大量編碼活性氧逆境相關(guān)酶，如過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、氧化還原蛋白、谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶等的基因，可以幫助松材線蟲抵御活性氧毒害[80]。 嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia與松材線蟲共生過(guò)程中可以通過(guò)調(diào)控線蟲寄生、免疫和致病相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)線蟲的致病性和繁殖力[81－82]。 同樣，熒光假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌可通過(guò)提高松材線蟲的抗氧化酶活性，增強(qiáng)松材線蟲在氧脅迫下的運(yùn)動(dòng)行為能力，增強(qiáng)了松材線蟲的抗氧化能力，降低寄主體內(nèi)活性氧含量[83]。 松材線蟲接種馬尾松12 h 后，基于16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，具有外源性生物降解和代謝、萜烯和聚酮類物質(zhì)代謝、運(yùn)輸和分解代謝等功能的微生物大量富集[84]。 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)松材線蟲可以代謝蒎烯等外源性有毒物質(zhì)，但松材線蟲本身缺少萜烯化合物降解的功能途徑[53]，而在松材線蟲伴生微生物的宏基因組中發(fā)現(xiàn)了α－蒎烯降解的完整途徑[85]，說(shuō)明松材線蟲伴生微生物可能在其致病過(guò)程中對(duì)這些外源性有毒物質(zhì)的降解和代謝起著重要作用，但無(wú)論是直接分泌植物毒素導(dǎo)致病害發(fā)生還是降解植物防御物質(zhì)促進(jìn)松材線蟲致病的作用機(jī)制均還需進(jìn)一步研究。

3 松樹內(nèi)棲微生物在致病過(guò)程中的作用

3.1 對(duì)松材線蟲種群的影響

松材線蟲病后期，松樹徹底枯死后，松材線蟲從寄生階段轉(zhuǎn)變?yōu)楦A段，以松樹內(nèi)棲真菌為食[50]，維持松材線蟲種群生存和繁殖，為再次侵染提供可能。 灰葡萄孢Botrytis cinerea、長(zhǎng)喙殼Ceratocystissp. 、色二孢Diplodiasp. 、盤多毛孢Pestalotiasp. 、大莖點(diǎn)霉Macrophomasp. 、鐮刀菌Fusariumsp. 、Ophiostomasp. 、孢子絲菌Sporothrixsp. 、帚梗孢菌Leptographiumsp. 、木霉Trichodermasp. 等內(nèi)棲微生物在體外培養(yǎng)條件下可促進(jìn)松材線蟲種群增長(zhǎng)[86]；多孔菌Trichaptum abietinum、節(jié)叢孢菌Arthrobotryssp. 、條紋黏褶菌Gloeophyllum striatum、隱 孔 菌Cryptoporus volvatus、Ophiostoma ips和Ophiostoma minus、外生菌根菌Crytosporiopsissp. 、帚梗孢菌Leptographiumsp. 、盤多毛孢Pestalotiasp. 、大莖點(diǎn)霉Macrophomasp. 可在寄主體內(nèi)促進(jìn)松材線蟲種群數(shù)量增長(zhǎng)[86]。 不同地區(qū)病木內(nèi)棲微生物存在種類差別，不同種類的內(nèi)棲微生物對(duì)松材線蟲種群數(shù)量具有不同的影響[87]。 松樹常見內(nèi)棲微生物灰葡萄孢和Sphaeropsis conigenus能顯著促進(jìn)松材線蟲種群增長(zhǎng)，松材線蟲也能在松球殼孢菌Sphaeropsis sapinea、Ophiostoma ips、 帚 梗 孢 菌Leptographium terebrantis上 生 長(zhǎng)[88]。 長(zhǎng) 喙 殼 菌Ceratostomellasp. 、鐮刀菌Fusariumsp. 等體外培養(yǎng)的松材線蟲種群繁殖率顯著比灰葡萄孢和盤多毛孢Pestalotiasp. 培養(yǎng)的高[89]。 松樹內(nèi)棲微生物在提供食物營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生某些化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)松材線蟲的繁殖，影響媒介昆蟲攜帶松材線蟲的數(shù)量。 從灰葡萄孢中提取的類似激素的化學(xué)物質(zhì)3 －辛醇和1 －辛烯3 －醇，對(duì)松材線蟲具有引誘、促進(jìn)蛻皮和繁殖作用，可能在促進(jìn)松材線蟲迅速繁殖過(guò)程中有重要作用[90]。 部分松樹微生物表現(xiàn)出殺松材線蟲活性，如Trichodermasp.3 菌株能顯著降低松材線蟲種群數(shù)量[91]。 從云南松P.yunnanensis內(nèi)分離到一種殺線蟲真菌Eysteya vermicola，能產(chǎn)生黏附性新月形孢子，粘附并寄生松材線蟲，最終導(dǎo)致松材線蟲死亡[92－93]。 因此，E.vermicola是寄主松樹內(nèi)棲真菌，同時(shí)還具有殺線蟲活性。

3.2 松樹內(nèi)棲微生物多樣性與松樹抗性的相關(guān)性

松材線蟲病侵染會(huì)影響松樹內(nèi)棲微生物多樣性，松樹內(nèi)棲微生物的差異也影響其對(duì)松材線蟲病的抗性。 松材線蟲入侵后，誘導(dǎo)黑松[94]、馬尾松等[95－96]松樹內(nèi)棲微生物豐富度及優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)生變化。 Zhang 等[96]通過(guò)16S 擴(kuò)增子研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲侵染后，馬尾松的內(nèi)棲細(xì)菌類芽孢桿菌屬Paenibacillus、伯克氏菌科Burkholderiaceae 的未定名屬、沙雷氏菌屬Serratia、歐文氏菌屬Erwinia、假黃色單胞菌屬Pseudoxanthomonas和內(nèi)棲真菌Penicillifer屬、接合囊酵母屬Zygoascus、Kirschsteiniothelia屬、Cyberlindnera屬和孢子絲菌屬Sporothrix的豐富度均高于健康馬尾松。 抗性松樹濕地松Pinus elliottii、加勒比松P.caribaea和火炬松P.taeda與感病松樹馬尾松內(nèi)棲微生物存在顯著差異。 抗性松樹中熱酸菌屬Acidothermus和普雷沃氏菌科Prevotellaceae 含量較高，歐文氏菌屬含量較低。 而感病松樹中歐文氏菌屬含量較高。 這些說(shuō)明了松樹內(nèi)棲微生物的多樣性和豐富度與松材線蟲病發(fā)生過(guò)程中存在相關(guān)性，但具體哪些種類關(guān)系更為緊密，其作用程度以及作用機(jī)制還需深入研究。

4 結(jié)語(yǔ)

關(guān)于松材線蟲的致病機(jī)理一直是松材線蟲病研究的熱點(diǎn)，近十多年該領(lǐng)域的研究富有成就，研究者們從不同角度給予了探索，取得了許多進(jìn)展，明確了許多基本問(wèn)題。 如大量的研究表明松材線蟲是松材線蟲病的病原，是病害的直接致病因素；并且在確定病原的基礎(chǔ)上，利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、RNA 測(cè)序、蛋白質(zhì)組及RNAi 技術(shù)對(duì)松材線蟲一些基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證分析，但由于寄主松樹生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、遺傳背景不清楚、且寄主轉(zhuǎn)基因體系不夠成熟，很難對(duì)其進(jìn)行模式化研究；同時(shí)由于松材線蟲體型較小且雌雄異體，很難獲得性狀穩(wěn)定遺傳的純合蟲株給基因編輯帶來(lái)了困難。 因此，目前的研究更多的只是在其他模式生物如本氏煙和秀麗隱桿線蟲中進(jìn)行驗(yàn)證，還缺乏松樹與松材線蟲互作體系中獲得致病基因作用的直接證據(jù)，由此限制了松材線蟲致病機(jī)理的研究。因此，建立寄主松樹與病原松材線蟲轉(zhuǎn)基因體系是松材線蟲致病機(jī)理研究急需解決的技術(shù)問(wèn)題。 基于有效的互作體系，篩選寄主松樹與松材線蟲直接互作因子，多層次多水平系統(tǒng)地研究松材線蟲多基因協(xié)同致病機(jī)理是松材線蟲致病機(jī)制未來(lái)研究的主要方向。

同時(shí)大量的研究也表明，松材線蟲伴生微生物或松樹內(nèi)棲微生物對(duì)松材線蟲的生命活動(dòng)有重要影響，它們可間接地對(duì)線蟲的致病性產(chǎn)生加強(qiáng)或減弱的作用。 如研究推測(cè)松材線蟲伴生微生物分泌植物毒素或通過(guò)分泌降解松樹防御物質(zhì)從而促進(jìn)松材線蟲的致病，發(fā)現(xiàn)松材線蟲侵染影響松樹內(nèi)棲微生物的群落變化及不同抗性松樹微生物群落差異顯著等。 這些結(jié)果給我們進(jìn)一步針對(duì)松材線蟲致病機(jī)理研究提供了新的思路，這些微生物群落結(jié)構(gòu)在其致病過(guò)程中的作用到底如何? 又是哪些微生物種群在起作用，哪些是核心菌群及其如何作用，這些可以在通過(guò)基因編輯研究松材線蟲致病分子機(jī)理的同時(shí)開展研究，共同推進(jìn)松材線蟲病的研究。 此外，發(fā)現(xiàn)一些松樹內(nèi)棲微生物被證明促進(jìn)繁殖或具有殺線活性，但該結(jié)果更多的是實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)或在幼苗上試驗(yàn)，在田間效果如何，是否在多種松樹上定殖，在松材線蟲致病過(guò)程中是否起關(guān)鍵作用及其作用機(jī)制還有待深入研究。