管立平，謝晶晶，李偉豪，陳昊震，溫振中，孫成波,2,3

(1 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(湛江)，廣東 湛江 524025；3 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)原產(chǎn)于太平洋沿岸水域，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)肉率高等優(yōu)點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖[1]。隨著凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，經(jīng)歷了數(shù)年大規(guī)模高密度養(yǎng)殖，養(yǎng)殖生產(chǎn)中用藥量不斷增加，導(dǎo)致水環(huán)境污染負(fù)荷日益加重、病害頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響到了水產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，促使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注通過(guò)運(yùn)用微生物制劑凈化養(yǎng)殖尾水及循環(huán)利用的研究及方法[2-5]。

微生物制劑被廣泛運(yùn)用及微生物制劑的研究證實(shí)有利于增強(qiáng)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的免疫能力和提升凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的綜合效益，但在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的過(guò)程中，需充分考慮具體的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境以及相關(guān)影響因子，科學(xué)運(yùn)用微生態(tài)調(diào)控技術(shù)，制定有效的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖方案，保障養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的品質(zhì)安全，盡可能降低凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖對(duì)環(huán)境的污染，減少疾病的發(fā)生，達(dá)到凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的可持續(xù)的發(fā)展[6]。在常用的微生態(tài)制劑中，芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、耐氧化、耐酸堿等特點(diǎn)從而成為研究熱點(diǎn)[7]。同時(shí)芽孢桿菌具有促進(jìn)生長(zhǎng)和預(yù)防疾病的作用，可作為抗生素的替代品、飼料添加劑和水質(zhì)調(diào)節(jié)控制劑[8-9]。目前國(guó)內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)研究的芽孢桿菌主要為枯草芽孢桿菌[10]、地衣芽孢桿菌[11]、蠟樣芽孢桿菌[12]和凝結(jié)芽孢桿菌[13]，而賴氨酸芽孢桿菌的相關(guān)研究主要還是處于分離篩選鑒定試驗(yàn)中[14]，并未做相關(guān)的水產(chǎn)養(yǎng)殖驗(yàn)證試驗(yàn)。

本研究通過(guò)已篩選出的賴氨酸芽孢桿菌，以持續(xù)潑灑的方式[15]，探討賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖水質(zhì)凈化效果和生長(zhǎng)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 賴氨酸芽孢桿菌

本實(shí)驗(yàn)室從廣東省沿海對(duì)蝦地膜精養(yǎng)池篩選的一株賴氨酸芽孢桿菌經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送至生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，以確定菌株的種類和分類地位。

利用 MEGA 7.0 軟件中的基于1 000次bootstrap重復(fù)算法的neighbor-joining方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示，可得試驗(yàn)菌株為賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)成員。配制濃度為0.463×109CFU/mL的賴氨酸芽孢桿菌菌液。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的賴氨酸芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

1.2 試驗(yàn)對(duì)蝦及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地內(nèi)進(jìn)行，利用300 L試驗(yàn)桶裝經(jīng)過(guò)濾沉淀、含氯消毒劑消毒和曝氣的天然海水250 L，放養(yǎng)125尾凡納濱對(duì)蝦/桶，微管曝氣增氧，自然光照，試驗(yàn)全程采用全封閉零交換水模式。凡納濱對(duì)蝦取自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，平均體長(zhǎng)為(9.40±0.18)cm，體質(zhì)量(5.18±0.13)g，附肢完整、健康、活力好。試驗(yàn)設(shè)1個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行，量取 25 mL賴氨酸芽孢桿菌菌液，賴氨酸芽孢桿菌使用量為0.463×104CFU/mL，每隔3 d使用1次，試驗(yàn)10 d。投喂餌料4次/d，投喂6.25 g/次，投喂時(shí)間為07：00、11：00、15：00、19：00。

1.3 樣品采集與處理

試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)各測(cè)定一次凡納濱對(duì)蝦體長(zhǎng)和體質(zhì)量。每天14：00利用注射器抽吸法在水面下方 5.00 cm 處采集水樣并測(cè)定對(duì)蝦養(yǎng)殖水體溫度、pH和鹽度。

1.4 試驗(yàn)參數(shù)的計(jì)算方法

L=Lt-L0

(1)

W=Wt-W0

(2)

S=(St/S0)×100%

(3)

F=Ft/W

(4)

式中：L為增體長(zhǎng)量，cm；Lt為終末體長(zhǎng)，cm；L0為初始體長(zhǎng)，cm；W為增體質(zhì)量，g；Wt為終末體質(zhì)量，g；W0為初始體質(zhì)量，g；S為存活率；St為終末存活尾數(shù)；S0為初始存活尾數(shù)；F為投飼系數(shù)；Ft為投喂飼料總量。

1.5 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定方法

銨態(tài)氮含量按照(HJ 535—2009)標(biāo)準(zhǔn)采取靛酚藍(lán)法測(cè)定[16]；亞硝酸鹽氮含量按照(GB 7493—87)標(biāo)準(zhǔn)采用 N-(1-萘基)-己二胺分光光度法測(cè)定[16]；硝酸鹽氮含量按照按(GB 17378.4—1998-39)標(biāo)準(zhǔn)采用鋅-鎘還原法測(cè)定[16]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)列出變化趨勢(shì)圖和運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)單因素ANOVA方差分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表述[17]。

2 結(jié)果

2.1 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)存活的影響

凡納濱對(duì)蝦飼養(yǎng)10 d后，凡納濱對(duì)蝦的體質(zhì)量(體長(zhǎng))、存活率及投飼系數(shù)如表1所示，其中整體試驗(yàn)組存活率(77.07%±1.22%)與對(duì)照組存活率(71.73%±2.81%)存在顯著性差異(P<0.05)，而試驗(yàn)組和對(duì)照組的體長(zhǎng)(體質(zhì)量)增長(zhǎng)和投飼系數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但試驗(yàn)組體長(zhǎng)增長(zhǎng)(0.37±0.17)cm、體質(zhì)量增長(zhǎng)(1.88±0.50)g高于對(duì)照組體長(zhǎng)增長(zhǎng)(0.23±0.10)cm、體質(zhì)量增長(zhǎng)(1.57±0.09)g且相比于對(duì)照組的投飼系數(shù)(1.78±0.12)，添加賴氨酸芽孢桿菌的試驗(yàn)組(投飼系數(shù)：1.47±0.45)能有效降低0.31。

表1 凡納濱對(duì)蝦的體質(zhì)量(體長(zhǎng))、存活率及投飼系數(shù)

2.2 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)水體理化因子的影響

圖2 芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

圖3 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

圖4 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水樣的含量的影響

2.2.4 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水樣的pH的影響

圖5 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的pH的影響

3 討論

3.1 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)存活的影響

本試驗(yàn)中，添加賴氨酸芽孢桿菌試驗(yàn)組中凡納濱對(duì)蝦的體質(zhì)量(體長(zhǎng))增長(zhǎng)和投飼系數(shù)降低較對(duì)照組有差異不顯著，其中試驗(yàn)組(A組、C組)投飼系數(shù)均低于對(duì)照組且試驗(yàn)組存活率顯著高于對(duì)照組，這與李軍亮等[18]的研究結(jié)果中相似的是添加枯草芽孢桿菌可提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能和降低餌料系數(shù)，與劉強(qiáng)強(qiáng)等[15]的添加芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的增重率有不同程度上的提高但差異不顯著以及飼料系數(shù)低于對(duì)照組的研究結(jié)果初步一致。這與芽孢桿菌的特性有關(guān)：1)芽孢桿菌能有效促進(jìn)養(yǎng)殖對(duì)象腸道發(fā)育，增加腸黏膜的厚度、腸絨毛的高度及細(xì)胞密度，其表面抗原或代謝物擔(dān)當(dāng)免疫原不斷刺激凡納濱對(duì)蝦的免疫防御系統(tǒng)，同時(shí)芽孢桿菌通過(guò)與有害細(xì)菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和附著位點(diǎn)，保護(hù)機(jī)體免受病原菌的侵染，提高存活率[19-22]；2)芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體具有較好的凈化的作用，給予養(yǎng)殖對(duì)象較好的生長(zhǎng)環(huán)境條件[23-24]。

3.2 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量的影響

3.3 賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體的pH的影響

在養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的過(guò)程，凡納濱對(duì)蝦的排泄物和未完全利用的餌料等有機(jī)氮硝化過(guò)程以及芽孢桿菌以養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物質(zhì)作為碳源進(jìn)行有氧呼吸，產(chǎn)生CO2[29]，都會(huì)致使水體中的pH逐漸下降，但賴氨酸芽孢桿菌的同化作用通過(guò)結(jié)合銨態(tài)氮和硝酸鹽氮合成自身所需的影響[28]，促使試驗(yàn)組的養(yǎng)殖水體的pH相對(duì)于對(duì)照組下降速度更緩慢且會(huì)進(jìn)行調(diào)控pH，試驗(yàn)組平均pH達(dá)到7.35，最低值為7.09，這與白利丹研究報(bào)告中結(jié)果相似[30]，若使pH維持在理想的范圍，可以通過(guò)持續(xù)增加磷鈣物或有益微生物濃度調(diào)節(jié)pH[31]。

3.4 賴氨酸芽孢桿菌的使用存在問(wèn)題及解決方法

芽孢桿菌的代謝和生長(zhǎng)容易受到環(huán)境等外界因素的變化而波動(dòng)，此次試驗(yàn)中，賴氨酸芽孢桿菌菌液直接潑灑到養(yǎng)殖水體，而水體中的其他菌群可能對(duì)其代謝和生長(zhǎng)有影響；再者養(yǎng)殖動(dòng)物體質(zhì)量大小不一，各個(gè)生長(zhǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)需求及適應(yīng)條件不同[10]，水環(huán)境因素，在養(yǎng)殖過(guò)程中滋生大量細(xì)菌對(duì)試驗(yàn)的影響等等，無(wú)法控制使用最適菌液濃度，導(dǎo)致效果不理想。解決方法：在有限的條件下，盡量控制變量因素，挑選規(guī)格大小相同對(duì)蝦，科學(xué)高效的養(yǎng)殖管理方式，進(jìn)行多次檢查試驗(yàn)桶，盡可能地將死蝦撈出計(jì)數(shù)，避免污染水質(zhì)，減小試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異。在實(shí)際應(yīng)用中，要想賴氨酸芽孢桿菌投入養(yǎng)殖水體后起到改善水質(zhì)的作用，需確保水體中活菌體濃度，才會(huì)有較好的效果[32]。

4 結(jié)論

通過(guò)持續(xù)添加賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和水質(zhì)初步研究表明，賴氨酸芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和存活有一定的作用，同時(shí)對(duì)于養(yǎng)殖水質(zhì)中的銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、pH具有顯著性的調(diào)控。賴氨酸芽孢桿菌是一種有益菌，利于養(yǎng)殖行業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展，可以推廣使用。

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