黃偉卿，陳宇光，張 藝，喬 瑩，馬笑晚，周逢芳,2，阮少江,2，丁建發(fā),2

(1 寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2 閩東水產(chǎn)品精深加工福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100；3 寧德市鼎誠(chéng)水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352100；4 福建省閩東水產(chǎn)研究所，福建 寧德 352100；5 自然資源部第四海洋研究所“中國(guó)-東盟國(guó)家海洋科技聯(lián)合研發(fā)中心”，廣西 北海 536000)

曼氏無(wú)針烏賊(Sepiellamaindronide Rochebrune)屬無(wú)針烏賊屬，俗稱墨魚(yú)，在中國(guó)廣泛地分布于黃海、東海等海域，浙江舟山是其主要原產(chǎn)區(qū)，與大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)、小黃魚(yú)(L.polyactis)和帶魚(yú)(Trichiuruslepturus)統(tǒng)稱為中國(guó)的四大經(jīng)濟(jì)捕撈水產(chǎn)品[1-2]。曼氏無(wú)針烏賊渾身是寶：烏賊墨和海螵蛸是用于止血的中藥材；內(nèi)臟富含不飽和脂肪酸、脂溶性維生素和豐富的未知生長(zhǎng)因子，常被用作動(dòng)物飼料和添加劑，具有良好誘食和助消化作用；肌肉富含氨基酸、蛋白質(zhì)等，具有較高的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。因其生長(zhǎng)速度較快、養(yǎng)殖周期短和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富等特點(diǎn)，21世紀(jì)初曼氏無(wú)針烏賊人工育苗技術(shù)被突破后，在浙江和福建等地已經(jīng)進(jìn)行規(guī)?；斯び绾驮鲋撤帕?，現(xiàn)已廣受人民喜愛(ài)和青睞的養(yǎng)殖品種之一。

鹽度作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要理化因子，主要通過(guò)影響胚胎的滲透壓平衡進(jìn)而影響發(fā)育時(shí)長(zhǎng)，當(dāng)滲透壓適宜時(shí)，胚胎內(nèi)的滲透壓會(huì)保持平衡，發(fā)育的速度較快，孵化率也較高，但當(dāng)胚胎處在高滲透壓的環(huán)境中時(shí)，胚胎發(fā)育時(shí)間將會(huì)大大縮短，但胚胎發(fā)育畸形的概率將會(huì)大幅度提高[4-8]。但經(jīng)鹽度脅迫也提高了魚(yú)類[9]、蝦類[10-12]、蟹類[13-14]、貝類[15-17]等水生動(dòng)物的生長(zhǎng)速度。目前，關(guān)于曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育的研究主要集中在發(fā)育時(shí)序[18]和水溫[19-21]的影響上，鹽度脅迫對(duì)曼氏無(wú)針烏賊的生長(zhǎng)發(fā)育的影響，僅見(jiàn)雷舒涵等[22]的研究，其結(jié)果表明鹽度30有助于提高曼氏無(wú)針烏賊的孵化率，但關(guān)于曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育能耐受的鹽度范圍和養(yǎng)成最適鹽度，至今未見(jiàn)報(bào)道。曼氏無(wú)針烏賊主要養(yǎng)殖區(qū)域福建省寧德市在養(yǎng)殖過(guò)程中常受臺(tái)風(fēng)、暴雨等惡劣天氣的影響，在室內(nèi)水泥池進(jìn)行曼氏無(wú)針烏賊育苗和養(yǎng)成生產(chǎn)過(guò)程中，因大暴雨導(dǎo)致養(yǎng)殖水體鹽度突變，造成大量死亡現(xiàn)象。

本研究旨在探明鹽度脅迫對(duì)曼氏無(wú)針烏賊的胚胎發(fā)育和生長(zhǎng)的影響，為開(kāi)展曼氏無(wú)針烏賊人工繁育、工廠化養(yǎng)殖和良種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受精卵來(lái)源

曼氏無(wú)針烏賊受精卵由寧德市南海水產(chǎn)科技有限公司提供，取同一時(shí)間產(chǎn)出的受精卵，從中挑選完成受精的黑色受精卵、剔除白色未受精的壞卵，平均卵徑(0.8±0.15)cm，卵質(zhì)量(0.21±0.05)g，受精卵采用活水車(chē)運(yùn)輸至寧德市鼎誠(chéng)水產(chǎn)有限公司進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在水溫(22.5±1.5)℃，將曼氏無(wú)針烏賊的受精卵分別置于試驗(yàn)組，鹽度分別為5(S5)、10(S10)、20(S20)、30(S30)和40(S40)，并以寧德地區(qū)野生曼氏無(wú)針烏賊生活海區(qū)水環(huán)境中鹽度24(S24)為對(duì)照組，設(shè)置方式每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。鹽度的調(diào)節(jié)以對(duì)照組鹽度24為基礎(chǔ)，采用經(jīng)48 h曝氣的自來(lái)水調(diào)制鹽度為5、10和20，采用海水晶調(diào)制鹽度為30和40。

將不同鹽度組別的曼氏無(wú)針烏賊繁育子代進(jìn)行人工養(yǎng)殖，研究鹽度脅迫對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響，養(yǎng)殖技術(shù)與管理參考常抗美等[20]。試驗(yàn)期間，分別在5 d、10 d、15 d和30 d時(shí)，每組取30尾曼氏無(wú)針烏賊，分別采用游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測(cè)量胴體長(zhǎng)和電子天平(精度0.001 g)稱量體質(zhì)量。

1.3 胚胎發(fā)育的觀察

因曼氏無(wú)針烏賊的受精卵呈現(xiàn)出黑色不透明的形態(tài)，無(wú)法直接在體視顯微鏡下進(jìn)行觀察，因此觀察前先將受精卵用鑷子沿突出處小心的剝開(kāi)，去除表層黑色的三級(jí)卵膜和乳白色的次級(jí)卵膜后，將胚胎放置于Leica DMS1000體視顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，記錄每個(gè)時(shí)期的發(fā)育進(jìn)程，并描述形態(tài)變化。每次每組均隨機(jī)取10個(gè)受精卵，觀察時(shí)間和發(fā)育時(shí)序參考蔣敏霞等[18]的方法進(jìn)行。

1.4 生物學(xué)統(tǒng)計(jì)

采用keys氏公式y(tǒng)=axb(a、b是擬合出來(lái)的系數(shù))擬合胴長(zhǎng)(x)與體質(zhì)量(y)的生長(zhǎng)式型[23]。

生長(zhǎng)性能統(tǒng)計(jì)公式：

XAGR=(L2-L1)/(t2-t1)

(1)

XAGRW=(m2-m1)/(t2-t1)

(2)

XSGRW=(lnm2-lnm1)/t× 100%

(3)

式中：XAGR—絕對(duì)增長(zhǎng)率(cm/d)；XAGRW—體質(zhì)量絕對(duì)增加率(g/d)；XSGRW—體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率(%/d)；m—體質(zhì)量(g)；L—胴體長(zhǎng)(cm)；t1、t2—試驗(yàn)初始、試驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間，d；m1、m2和L1、L2分別為t1、t2時(shí)的體質(zhì)量(g)和胴長(zhǎng)(cm)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 23.0處理軟件中用單因素方差分析和Duncan’s多重比較進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育的觀察

曼氏無(wú)針烏賊的胚胎發(fā)育共分為受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸期、胚孔封閉期、原基出現(xiàn)期、外器官形成期、肌肉效應(yīng)期、眼窩形成期、晶體形成期、心跳出現(xiàn)期、卵黃膜內(nèi)的胚胎、體色素出現(xiàn)期、內(nèi)骨骼形成期、尾腺出現(xiàn)期、緣膜出現(xiàn)期、剛出膜幼體17個(gè)階段(表1，圖1)。在水溫(22.5±1.5℃)的范圍內(nèi)，曼氏無(wú)針烏賊完成整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程需要時(shí)長(zhǎng)19～20 d(表1)。

表1 曼氏無(wú)針烏賊的胚胎發(fā)育的時(shí)間以及各個(gè)時(shí)期的形態(tài)特征

2.2 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育的影響

水溫(22.5±1.5)℃，鹽度20～30范圍時(shí)，胚胎發(fā)育時(shí)間隨鹽度的升高而縮短，試驗(yàn)組S30完成整個(gè)胚胎發(fā)育的時(shí)間最短為19 d 3 h，且孵化率為(90.5±4.4)%，顯著高于其他組(P<0.05)，試驗(yàn)組S5、S10和S40分別在胚胎發(fā)育至2細(xì)胞期、16細(xì)胞期和原腸晚期后停止發(fā)育(表2)。

表2 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育的影響

2.3 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊生長(zhǎng)性能的影響

分別擬合了1～30日齡試驗(yàn)組S20、S30和對(duì)照組S24的曼氏無(wú)針烏賊胴體長(zhǎng)(x)與體質(zhì)量(y)的生長(zhǎng)式型，結(jié)果如下：

試驗(yàn)組S20:y=0.145 2x2.856 8(R2=0.950 8)；

試驗(yàn)組S30：y=0.131 7x3.271 2(R2=0.943 8)；

對(duì)照組S24：y=0.125 8x3.450 5(R2=0.945 8)。

三者b≈3，即在此生長(zhǎng)環(huán)境下曼氏無(wú)針烏賊表現(xiàn)為等速生長(zhǎng)(圖2)。

圖2 不同鹽度曼氏無(wú)針烏賊生長(zhǎng)式型

經(jīng)30 d養(yǎng)殖后，試驗(yàn)組S30AGR、AGRW和SGRW分別為(0.12±0.02)cm/d、(0.33±0.12)g/d和(0.36±0.24)%/d，均顯著高于其他組(P<0.05)(表3)。

表3 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊生長(zhǎng)性能的影響

3 討論

3.1 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育的影響分析

鹽度的高低變化會(huì)影響海洋生物的滲透壓，而絕大部分的海洋生物對(duì)外界的鹽度變化都有調(diào)節(jié)機(jī)體本身滲透壓的能力[24]，有研究發(fā)現(xiàn)，在一些貝類[25]和魚(yú)類[9]的胚胎發(fā)育受鹽度變化影響顯著，鹽度越高，完成胚胎發(fā)育的時(shí)間越快。本次試驗(yàn)結(jié)果同樣表明，在鹽度20～30時(shí)曼氏無(wú)針烏賊胚胎發(fā)育速度與鹽度呈正比關(guān)系，這一結(jié)果與雷舒涵等[22]和陳四清等[26]的結(jié)果一致。但同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度達(dá)到40或鹽度小于10時(shí)無(wú)法完成整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)序，主要原因可能是卵膜難以調(diào)節(jié)卵內(nèi)外的物質(zhì)平衡而導(dǎo)致受精卵損傷或代謝失調(diào)。

劉振勇等[19]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曼氏無(wú)針烏賊受精卵的孵化率在鹽度22～30范圍內(nèi)隨著鹽度的升高而升高，孵化率在50%～90%之間，在鹽度21時(shí)存活率極低。雷舒涵等[22]研究結(jié)果表明，在鹽度15～30曼氏無(wú)針烏賊受精卵的孵化率隨著鹽度的升高而升高，在鹽度30～36曼氏無(wú)針烏賊受精卵的孵化率隨著鹽度的升高而降低，孵化率在鹽度30時(shí)達(dá)到最高，為77.8%，而其他鹽度孵化率均低于50%。本研究同樣證實(shí)，曼氏無(wú)針烏賊受精卵的孵化率在鹽度30時(shí)達(dá)到最高值，低于或高于鹽度30孵化率均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與陳四清等[26]研究一致，鹽度突變對(duì)曼氏無(wú)針烏賊受精卵卵液滲透壓的影響均極顯著(P<0.01)。鹽度由30向低鹽處理突變時(shí)，受精卵卵液滲透壓均顯著降低，而向高鹽處理組突變時(shí)，卵液滲透壓則顯著升高(P<0.01)。而滲透壓的升高或降低均能導(dǎo)致卵膜難以調(diào)節(jié)細(xì)胞與周?chē)橘|(zhì)之間的物質(zhì)平衡而導(dǎo)致受精卵損傷或代謝失調(diào)所致，從而導(dǎo)致孵化率的降低。

3.2 鹽度對(duì)曼氏無(wú)針烏賊生長(zhǎng)性能的影響分析

養(yǎng)殖水體鹽度變化是影響魚(yú)類生存和生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子。鄭偉剛等[27]研究表明，適宜的鹽度有利于促進(jìn)魚(yú)類攝食、生長(zhǎng)和餌料利用，但超過(guò)適宜范圍時(shí)就會(huì)明顯影響魚(yú)類生長(zhǎng)，這與鹽度影響魚(yú)類體內(nèi)消化酶活性和能量分配等原因有關(guān)[28-29]。對(duì)于頭足類動(dòng)物，不同的種類對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍均有所差異，擬目烏賊(Sepialycidas)生長(zhǎng)適宜的鹽度是21～33，最適鹽度為27～30[30]；長(zhǎng)蛸(Octopusvariabilis)生長(zhǎng)的適宜鹽度范圍為16.3～27.3，最適鹽度在18.3～24.3[31]；金烏賊(Sepiaesculent)生長(zhǎng)的適宜鹽度范圍24～37[26]；虎斑烏賊(Sepiapharaonis)幼體生長(zhǎng)的適宜鹽度范圍18～33，最適鹽度24～27[32]。本研究曼氏無(wú)針烏賊在鹽度20～30范圍內(nèi)生長(zhǎng)適宜，最適鹽度為30，較尹飛等[33]研究指出曼氏無(wú)針烏賊鹽度的適應(yīng)范圍11.73～31.43，最適鹽度19.61～26.18，鹽度有所差別，原因主要是曼氏無(wú)針烏賊為了適應(yīng)養(yǎng)殖區(qū)域環(huán)境，長(zhǎng)期經(jīng)受馴化所產(chǎn)生了差異。

3.3 關(guān)于曼氏無(wú)針烏賊的生長(zhǎng)式型

目前關(guān)于曼氏無(wú)針烏賊的生長(zhǎng)式型擬合較少，本次試驗(yàn)擬合了不同鹽度下1～30日齡的胴體長(zhǎng)(x)與體質(zhì)量(y)的生長(zhǎng)試型，結(jié)果與黃偉卿等[23]、蔣敏霞等[18]和張建設(shè)等[21]的擬合結(jié)果一致，回歸方程中b值均接近3，且R2值較高，擬合度較好，均表現(xiàn)出等式生長(zhǎng)的情況。焦海峰等[34]、姬廣聞[35]研究表明，鹽度與水產(chǎn)動(dòng)物的各種生理活動(dòng)關(guān)系密切,水生生物對(duì)鹽度都有一定的適宜范圍，超出適宜范圍可導(dǎo)致其自身與外界水體的滲透壓出現(xiàn)差異，需要消耗更多能量來(lái)維持滲透壓平衡，以至于用于其他方面的能量減少，會(huì)影響其生長(zhǎng)性能，超過(guò)其自身調(diào)節(jié)能力時(shí)可導(dǎo)致死亡。而曼氏無(wú)針烏賊同其他無(wú)針烏賊一樣,幼體對(duì)鹽度的耐鹽性隨著日齡的增長(zhǎng)而增強(qiáng)，這與其生理機(jī)能日漸完善，對(duì)滲透壓的調(diào)節(jié)能力逐漸加強(qiáng)有關(guān)[36]。因此隨著曼氏無(wú)針烏賊的生長(zhǎng)，曼氏無(wú)針烏賊長(zhǎng)時(shí)間對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖鹽度的適應(yīng)，從而導(dǎo)致不同區(qū)域養(yǎng)殖的鹽度變化所擬合生長(zhǎng)模型均存在差異。

4 結(jié)論

本研究將曼氏無(wú)針烏賊的胚胎發(fā)育時(shí)序分為17個(gè)階段，在水體鹽度30中完成整個(gè)胚胎發(fā)育的時(shí)間最短、且孵化率為最高，養(yǎng)殖周期30 d其體質(zhì)量絕對(duì)增加率、絕對(duì)增長(zhǎng)率和體質(zhì)量特定生長(zhǎng)率分別為(0.33±0.12)g/d、(0.12±0.02)cm/d和(0.35±0.24)%/d，顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，且生長(zhǎng)模式表現(xiàn)為等式生長(zhǎng)的規(guī)律，結(jié)果證明在養(yǎng)殖水體鹽度30更適宜曼氏無(wú)針烏賊生長(zhǎng)發(fā)育。這一結(jié)構(gòu)將對(duì)今后開(kāi)展曼氏無(wú)針烏賊室內(nèi)苗種培育和進(jìn)行可控的循環(huán)水養(yǎng)成技術(shù)具有重要的指導(dǎo)意義。

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