孟倩雅，馬桂霞，母銳敏，祁 峰，朱兆亮

（山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250000）

化石能源的過度使用導(dǎo)致以CO2為主的溫室氣體被大量排放〔1〕。為促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)碳中和目標(biāo)〔2〕，人類迫切需要尋求綠色可再生的新型能源，以應(yīng)對環(huán)境惡化帶來的挑戰(zhàn)。作為第三代生物質(zhì)能源，微藻因?qū)Νh(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、生長速率快、收獲周期短、油脂含量高〔3〕，在生物燃料、高價值生物分子等方面具有潛在用途〔4〕，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。利用微藻生產(chǎn)生物質(zhì)能源包括微藻的培養(yǎng)、采收、油脂提取和轉(zhuǎn)化幾個環(huán)節(jié)，其中微藻的采收是微藻生物質(zhì)利用的最關(guān)鍵步驟。

微藻的個體微小，細(xì)胞密度小，采收困難，采收成本較高（占總生產(chǎn)成本的20%～30%〔5〕）。此外，考慮到微藻的資源化利用，應(yīng)盡可能減少采收導(dǎo)致的藻類死亡〔6〕。傳統(tǒng)的物理、化學(xué)采收方法具有技術(shù)手段成熟、絮凝機(jī)理清晰、采收效率較高的優(yōu)點(diǎn)，但成本高、能耗高，且往往對下游工藝造成影響，增加了微藻生物質(zhì)能源的利用難度〔7〕。而微藻的單一培養(yǎng)對環(huán)境要求高，易被細(xì)菌污染，且需要額外的營養(yǎng)物質(zhì)供給，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)與利用。基于此，藻-菌共生生物技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。一方面，藻-菌共生體系對環(huán)境有高度的適應(yīng)性〔8〕，擁有更強(qiáng)的抗逆能力；另一方面，該體系在減少CO2排放的同時〔9〕，還能利用生物絮凝方式促進(jìn)藻類能源物質(zhì)的產(chǎn)出和利用，實(shí)現(xiàn)污水凈化與生物質(zhì)能源回收利用的雙重耦合。

微藻在污水處理及生物質(zhì)能源產(chǎn)出中優(yōu)勢顯著，但以生物絮凝法為重點(diǎn)的微藻生物絮凝采收技術(shù)尚未得到足夠關(guān)注，目前有關(guān)研究也較為分散。筆者在簡單梳理微藻采收主要技術(shù)方法的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)論述了以藻-菌共生污水處理系統(tǒng)中各種微生物為介導(dǎo)的新型生物絮凝法，旨在尋求節(jié)能高效、更具商業(yè)價值和發(fā)展?jié)摿Φ男滦托跄墒占夹g(shù)，以期為今后微藻生物質(zhì)能源的商業(yè)化應(yīng)用提供理論和技術(shù)支持。

1 傳統(tǒng)絮凝采收方法

1.1 物理采收法

傳統(tǒng)的物理采收方法主要有浮選、離心、重力沉降、過濾及超濾、膜分離等〔10〕，其機(jī)理及優(yōu)缺點(diǎn)如表1所示。

表1 傳統(tǒng)物理采收方法的采收機(jī)理及優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Harvesting mechanism，advantages and disadvantages of traditional physical harvesting methods

1.2 化學(xué)絮凝法

絮凝作用的一般機(jī)制有壓縮雙電層、電荷中和、吸附架橋、網(wǎng)捕卷掃。絮凝作用造成藻類懸浮液不穩(wěn)定往往是一種或多種機(jī)制共同作用的結(jié)果〔15〕。常用化學(xué)絮凝劑及其特點(diǎn)見表2。

表2 傳統(tǒng)無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑的特點(diǎn)Table 2 Characteristics of traditional inorganic and organic flocculants

綜上可知，不同化學(xué)采收法對微藻中脂質(zhì)含量的影響差別不大〔26〕，但會影響脂質(zhì)成分〔27〕。使用絮凝劑幫助回收微藻需要向系統(tǒng)添加化學(xué)物質(zhì)，使得總?cè)芙夤腆w增加〔28〕，根據(jù)絮凝劑和藻種的不同，其在循環(huán)水中的殘留物可能會抑制或阻止藻類再次生長。

2 生物絮凝法

微藻的傳統(tǒng)采收方法中，物理采收法普遍能耗較高，成本升高；化學(xué)絮凝劑會導(dǎo)致污染；電絮凝法則需要昂貴的交換電極〔26〕，且普適性較差。需開發(fā)成本低廉、環(huán)境友好且普適性高的新型絮凝方式，以滿足當(dāng)前微藻生物能源工藝的需要。生物絮凝法利用微藻自身分泌物或與微藻共培養(yǎng)的其他生物細(xì)胞誘導(dǎo)，促使目標(biāo)微藻絮凝〔15〕。其中細(xì)菌和真菌均有良好的微藻收獲潛力，其機(jī)理如圖1所示。

圖1 生物絮凝法機(jī)理Fig.1 Mechanism of bioflocculation

2.1 微藻自絮凝法

微藻自絮凝是培養(yǎng)基中的微藻在細(xì)胞特殊的表面特性或胞外分泌物作用下，不添加絮凝劑而彼此聚集黏附，自發(fā)生成絮凝物進(jìn)而沉淀的現(xiàn)象〔16〕。1965年就有研究者發(fā)現(xiàn)，微藻在光線充足的池塘中能夠自發(fā)形成絮體。研究表明，微藻自絮凝過程存在橋接和修補(bǔ)機(jī)制。當(dāng)微藻細(xì)胞之間形成大的微藻細(xì)胞網(wǎng)時，涉及的機(jī)制為橋接；當(dāng)微藻細(xì)胞之間更緊密附著，涉及的機(jī)制可能是通過絮凝微藻分泌的胞外多糖進(jìn)行修補(bǔ)〔29〕。目前公認(rèn)的微藻自絮凝機(jī)制有2種：（1）高pH條件下微藻懸濁液中形成帶正電的離子沉淀物，在電荷中和作用下誘發(fā)絮凝〔30〕。微藻通過光合作用消耗水中的CO2，使pH升高，促進(jìn)正磷酸鹽的沉淀，吸附并與帶負(fù)電的微藻反應(yīng)，最終導(dǎo)致微藻的聚集和沉淀〔31〕。（2）部分藻種生理活動產(chǎn)生的胞外聚合物（EPS）能夠作為生物絮凝劑誘發(fā)絮凝〔30〕。EPS是由微藻細(xì)胞壁分泌的一層黏性基質(zhì)，主要由碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、核酸、糖蛋白和磷脂組成〔32〕。研究發(fā)現(xiàn)〔33〕，微藻絮凝活性的增強(qiáng)與EPS的碳水化合物濃度密切相關(guān)，雖然EPS作為生物絮凝劑不會增加微藻自身的脂質(zhì)含量，但可提高38%～88%的微藻脂質(zhì)產(chǎn)量，使藻類的絮凝收獲速度提高1.4～1.9倍。Meng WANG等〔34〕研究表明，在高氮低磷的污水條件下培養(yǎng)有助于Chlorellasp.和Micractiniumsp.EPS的產(chǎn)生。

利用微藻的自絮凝直接進(jìn)行絮凝采收，一方面可提高絮凝效率，避免二次污染，另一方面降低了微藻細(xì)胞收獲過程的總成本〔35〕。其缺點(diǎn)在于并非所有種類的微藻都存在自絮凝〔36〕。

2.2 自絮凝微藻介導(dǎo)的微藻生物絮凝

目前已鑒定的微藻物種中只有少數(shù)具有自絮凝能力，如Ankistrodesmus falcutus〔37〕、C.vulgarisJSC-7、Ettlia texensisSAG79.80、Scenedesmus obliquus。一些研究者嘗試用自絮凝藻種增強(qiáng)非絮凝微藻細(xì)胞的絮凝作用。Suolian GUO等〔38〕對自絮凝藻種Scenedesmus obliquusAS-6-1的胞外聚合物進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)多種自由懸浮的微藻細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈絮凝，這是對自絮凝微藻絮凝劑特性的首次報道。S.SALIM等〔39〕將自絮凝活性較好但脂質(zhì)產(chǎn)量較低的自絮凝藻種Scenedesmus obliquus與非絮凝產(chǎn)油藻共同培養(yǎng)，明顯縮短了非絮凝微藻的回收時間，并獲得較高的脂質(zhì)產(chǎn)量和采收率。M.A.ALAM等〔40〕用Chlorella vulgarisJSC-7作為自絮凝微藻絮凝劑，對自由懸浮的C.vulgarisCNW11和Scenedesmus obliquusFSP進(jìn)行絮凝采收，采收率達(dá)到80%以上。

自絮凝藻種與非絮凝藻種共同培養(yǎng)不需要額外的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)系統(tǒng)。此外，自絮凝微藻也可以積累脂質(zhì)，進(jìn)一步向下游加工成生物柴油，且不涉及額外的操作和投資成本來處理沉積物（微藻生物量）〔39〕。整個絮凝過程無需添加任何化學(xué)物質(zhì)，是一種無污染、可持續(xù)且經(jīng)濟(jì)有效的采收方法。

與自絮凝微藻絮凝劑類似，近年來諸多研究者以低毒性且絮凝快速的天然植物基絮凝劑作為聚合物絮凝劑的替代品，將植物來源的生物聚合物絮凝劑用于廢水處理，收獲微藻生物量〔41〕。但與自絮凝微藻絮凝劑相比，天然植物基絮凝劑的絮凝效率中等，絮凝采收能力并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，又因涉及提取工藝問題，采收成本增加，故在此不再贅述。

2.3 細(xì)菌介導(dǎo)的微藻生物絮凝

藻、菌之間的關(guān)系主要有互利共生與競爭抑制兩類〔42〕，在自然條件下，微藻很難保持單一純藻或混藻狀態(tài)，而往往會與細(xì)菌形成藻-菌共生體。相比單藻培養(yǎng)和細(xì)菌培養(yǎng)，藻-菌共生培養(yǎng)方式對環(huán)境變化有高度適應(yīng)性〔8〕，且在利用藻類處理污水的技術(shù)中，藻-菌共生系統(tǒng)具有更強(qiáng)的凈化優(yōu)勢〔43〕。在藻-菌共生水處理體系中，微藻的絮凝過程是藻-藻、藻-菌、菌-菌與污水中物質(zhì)等共同作用的結(jié)果〔30〕。Chun WAN〔35〕等從活性污泥中分離出一株生物絮凝劑產(chǎn)生菌Solibacillus silvestris，培養(yǎng)48 h后，產(chǎn)生的生物絮凝劑對具有良好產(chǎn)脂潛力的海洋微藻Nannochloropsis oceanicaDUT01的最高絮凝率可達(dá)90%。該生物絮凝劑對Nanno?chloropsis oceanicaDUT01藻細(xì)胞的生長無不良影響，因此可重復(fù)使用以降低采收成本。

事實(shí)上，藻-菌共生系統(tǒng)中細(xì)菌對藻類絮凝的影響是復(fù)雜的，細(xì)菌的多種代謝分泌物均可促進(jìn)微藻細(xì)胞的絮凝。A.RAY等〔44〕研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)生的γ-谷氨酸可以產(chǎn)生聚γ-谷氨酸，而聚γ-谷氨酸被證明是一種有效的生物絮凝劑。當(dāng)細(xì)菌胞外分泌物用作生物絮凝劑時，絮凝效率比化學(xué)絮凝劑（如聚丙烯酰胺和硫酸鋁）高得多，收獲率達(dá)到70%以上。Paenibacillussp.AM49在pH為11的條件下對Chlorella vulgaris的絮凝率達(dá)到86%。細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液用作絮凝劑時，在適宜的pH和溫度條件下，微藻細(xì)胞能在5 min內(nèi)快速沉淀，絮凝率為83.67%。Jimin LEE等〔5〕對Chlorella vulgaris進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無菌培養(yǎng)物獲得2%的絮凝活性，細(xì)菌培養(yǎng)物則獲得94%的絮凝活性。進(jìn)一步研究證明，細(xì)菌通過胞外代謝物增加絮凝物的大小使微藻沉淀，絮凝物的尺寸比其實(shí)際性質(zhì)更能影響微藻絮體的沉降特性。

細(xì)菌分泌產(chǎn)生的EPS在活性污泥表面和絮體內(nèi)普遍存在，可通過吸附作用將懸濁液中的微藻富集起來，形成的聚生體在抵御對細(xì)胞有毒有害的物質(zhì)時表現(xiàn)良好。除了能分泌EPS，微藻還能分泌可溶于水的前體物質(zhì)，形成一種透明的胞外顆粒物（TEP）〔45〕。TEP類似于EPS，但在尺寸和結(jié)構(gòu)上更大〔46〕。研究表明，異養(yǎng)細(xì)菌與微藻的相互作用可能影響TEP的形成和微藻聚集，增加聚集體的形成和顆粒的下沉〔47〕，對污水環(huán)境中的生物絮凝和收獲有很大的潛在影響〔48〕。

酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）是革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的一種通訊信號，是細(xì)菌群體感應(yīng)反應(yīng)的介體〔49〕。研究發(fā)現(xiàn)，藻類能夠感知并響應(yīng)AHLs信號，細(xì)菌可利用AHLs影響微藻的基因表達(dá)，誘導(dǎo)微藻的自絮凝。Dandan ZHOU等〔50〕研究表明Chlorophytasp.通過分泌芳香蛋白對AHLs作出響應(yīng)，促進(jìn)該藻的自絮凝。沒有AHLs存在下藻細(xì)胞基本處于自由懸浮狀態(tài)，而AHLs存在時微藻的絮凝沉降效率高達(dá)41%。

污水處理中的藻-菌共生系統(tǒng)利用的是藻類和細(xì)菌之間的共生關(guān)系〔51〕?；旌显孱惖墓夂献饔门c細(xì)菌群落的呼吸作用之間存在有機(jī)、無機(jī)養(yǎng)分的交換，使得微藻生物量激增〔52〕，可沉降絮凝物的形成與微藻相關(guān)細(xì)菌及其胞外代謝物之間存在直接的相關(guān)性。在對微藻絮凝采收并加以利用的整體工藝過程中，細(xì)菌作為一個整體可能比單獨(dú)的細(xì)菌胞外代謝物發(fā)揮更深遠(yuǎn)的作用〔5〕。微藻收獲與油脂提取相結(jié)合是能量密集型工藝，約占工藝過程總能量的90%〔53〕。藻類細(xì)胞壁堅硬而厚，由復(fù)雜的碳水化合物和糖蛋白組成，因而需要額外的預(yù)處理步驟破壞微藻細(xì)胞壁，以大量回收脂質(zhì)〔48〕。寄生于藻類細(xì)胞壁或其相關(guān)鞘中的細(xì)菌可促進(jìn)微藻細(xì)胞壁降解〔54〕，從而大大降低操作能量。此外，細(xì)菌的倍增時間短、絮凝效率高，基于細(xì)菌的絮凝不受化學(xué)污染。但該過程會導(dǎo)致微生物污染，可能影響用于食品生產(chǎn)的微藻生物量的質(zhì)量，因而以細(xì)菌為介導(dǎo)的微藻生物絮凝更適于生物燃料的生產(chǎn)〔26〕，該方法的物種特異性和環(huán)境安全性限制了其在工程中的規(guī)?；瘧?yīng)用〔44〕。

2.4 真菌介導(dǎo)的微藻生物絮凝

不同于細(xì)菌通過細(xì)胞黏附或胞外分泌物誘導(dǎo)微藻絮凝，絲狀真菌作為一類有代表性的生物絮凝劑，能夠自行造粒，對微藻的捕獲效率高〔55〕。真菌的自制?？赏ㄟ^凝固機(jī)制和非凝固機(jī)制解釋。在曲霉屬代表中觀察到的凝固機(jī)理涉及孢子凝結(jié)導(dǎo)致聚集體顆粒的形成，最終使真菌形成密集的球形聚集體〔56〕。非凝固機(jī)制則是孢子萌發(fā)成菌絲，進(jìn)而交織成小球。

Hui WANG等〔57〕在激光掃描共聚焦顯微鏡下對其培養(yǎng)的藻菌群落進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)絲狀真菌穿插在微藻細(xì)胞之間，與藻類細(xì)胞緊密結(jié)合。Wenguang ZHOU等〔58〕將絲狀真菌球粒形成菌與微藻在連續(xù)攪拌下共培養(yǎng)，形成體積遠(yuǎn)大于藻類的真菌-藻類顆粒，通過簡單的過濾即可收獲。研究發(fā)現(xiàn)，真菌制粒對藻類脂質(zhì)水平及廢水處理效率起到添加劑和協(xié)同作用〔55〕。此外，一些真菌的脂質(zhì)含量超過真菌總生物量的30%〔59〕，使得高油真菌成為良好的生物柴油原料，其可與含油微藻一起直接轉(zhuǎn)化為生物燃料，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。

Jiao JIANG等〔60〕首次利用細(xì)菌和絲狀真菌共同收獲污水中的小球藻。與細(xì)菌-微藻共生體相比，細(xì)菌-真菌-小球藻共生系統(tǒng)中形成了更緊密的絮體。細(xì)菌通過黏附與微藻糾纏形成細(xì)菌-小球藻絮體，絲狀真菌則通過橋接形成菌絲網(wǎng)捕獲細(xì)菌-小球藻絮體〔61〕，形成更穩(wěn)定的絮狀物。研究發(fā)現(xiàn)，添加的細(xì)菌和真菌對產(chǎn)油微藻的含油量和品質(zhì)并無負(fù)面影響。

生物絮凝，尤其是微藻輔助絮凝，是對其他需商業(yè)化的收獲方法的創(chuàng)新性改進(jìn)。采用這種方法可使微藻細(xì)胞不受損傷而保持完整性，相關(guān)投資成本可忽略不計。在工業(yè)規(guī)模上，培養(yǎng)基可以重復(fù)使用，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的投加成本和對水的需求〔29〕。

3 結(jié)論與展望

（1）在各項采收技術(shù)中，傳統(tǒng)絮凝采收方式的技術(shù)手段相對成熟，但普遍存在高能低效或二次污染問題，生物絮凝則有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

（2）通過基因改造開發(fā)新的高脂絮凝菌株是未來獲取微藻生產(chǎn)生物燃料的有效途徑。利用基因轉(zhuǎn)移對優(yōu)質(zhì)藻類菌株進(jìn)行工程改造以引發(fā)絮凝，或?qū)⒊蔀槲磥砩虡I(yè)化收獲微藻細(xì)胞最有前途的方法之一。

（3）對藻-菌系統(tǒng)中藻菌共生關(guān)系的深入研究，是人為調(diào)控和誘發(fā)微藻絮凝，獲取更清潔綠色生物燃料的關(guān)鍵所在。結(jié)合基因工程技術(shù)，以收獲生物質(zhì)的最終用途作為首要考慮因素，制定合適的收獲策略，同時在釋放轉(zhuǎn)基因菌株前評估其對生態(tài)環(huán)境的威脅，遵守環(huán)境友好、節(jié)能高效的生態(tài)要求，將為微藻生物燃料技術(shù)的工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持及長遠(yuǎn)的工藝保障。