蔣華夷，盧光衣，李怡歡，張倩茹，藤 丹，楊 銳，何紅平*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

斑籽木[Baliospermumsolanifolium(Burman) Suresh]為大戟科(Euphorbiaceae)斑籽木屬灌木，又名斑籽，產(chǎn)于亞洲南部和東南部各國(guó)，在我國(guó)主要分布于云南西南部[1]。斑籽木全株均可入藥，具有退熱、滋補(bǔ)、消腫、利尿、瀉下等功效，民間常用于治療哮喘、支氣管炎、黃疸、水腫、便秘、麻風(fēng)、皮膚病等癥[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，斑籽木提取物具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗過(guò)敏、抗氧化、保肝等多種藥理活性[2]。目前，關(guān)于斑籽木化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，已分離鑒定的化學(xué)成分主要包括二萜、苯丙素、生物堿等[2,4-5]。Ogura等[6]從斑籽木中分離得到的5個(gè)新的佛波醇酯型二萜類(lèi)化合物對(duì)淋巴細(xì)胞白血病P388細(xì)胞表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒活性；Pipatrattanaseree等[7]從斑籽木中分離得到的苯丙素類(lèi)化合物propioveratrone對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的生成表現(xiàn)出抑制作用；作者所在課題組對(duì)斑籽木地上部分化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從其90%乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離得到20個(gè)化合物。為進(jìn)一步闡明斑籽木的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，作者采用正相硅膠柱色譜、MCI柱色譜、半制備型高效液相色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜等分離方法對(duì)斑籽木地上部分90%乙醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

斑籽木，2019年3月采自云南省西雙版納州，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)張雪梅副研究員鑒定為大戟科斑籽木屬植物斑籽木[Baliospermumsolanifolium(Burman) Suresh]的地上部分，標(biāo)本(BS-201903001)保存于云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

柱色譜用硅膠(80～100目、100～200目、200～300目)，青島海洋化工廠(chǎng)；MCI凝膠(CHP20P，75～150 μm)，日本三菱化學(xué)公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠，美國(guó)GE公司；乙腈、甲醇，色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；其余試劑均為分析純或工業(yè)純，上海泰坦化學(xué)有限公司。

Bruker AM-400型和AV-500型核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；Hei-VAP Core HL/G3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)Heidolph公司；Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀[XDB-C18色譜柱(250 mm×9.4 mm，5 μm)，二極管陣列檢測(cè)器(DAD)]，美國(guó)Agilent公司；Newstyle NP7000型半制備型高效液相色譜儀，江蘇漢邦科技有限公司；GF254型薄層層析硅膠板，青島海洋化工廠(chǎng)；RP-C18薄層色譜板，美國(guó)EMD Millipore公司。

1.2 斑籽木地上部分化學(xué)成分的提取與分離

取斑籽木干燥地上部分20.0 kg，粉碎后用90%乙醇浸提4次，每次3 d；合并提取液，減壓濃縮得浸膏1.6 kg；將浸膏分散于適量水中，依次用石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，得到石油醚部位和乙酸乙酯部位；乙酸乙酯部位減壓濃縮得到浸膏800.0 g，經(jīng)硅膠(3.5 kg，80～100目)柱色譜分離，以石油醚-丙酮(1∶0～0∶1，體積比，下同)梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)合并相似組分，得到7個(gè)組分Fr.A～G。

Fr.A(20.0 g)經(jīng)硅膠(150 g，100～200目)柱色譜分離，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯洗脫，得到3個(gè)組分Fr.A1～A3。Fr.A1經(jīng)硅膠(80 g，200～300目)柱色譜分離，得到化合物Ⅶ(3.0 mg)。

Fr.B(120.0 g)經(jīng)MCI柱色譜分離，以甲醇-水(60%～90%)梯度洗脫，得到6個(gè)組分Fr.B1～B6。Fr.B5(15.7 g)經(jīng)硅膠(480 g，100～200目)柱色譜分離，以石油醚-丙酮[(200～1)∶1]梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.B5-1～B5-7；Fr.B5-5經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅳ(9.4 mg)；Fr.B6經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅴ(1.0 g)。

Fr.C(69.1 g)經(jīng)硅膠(691 g，100～200目)柱色譜分離，以石油醚-丙酮(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.C1～C7。Fr.C2(13.0 g)經(jīng)MCI柱色譜分離，以甲醇-水(60%～90%)梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr.C2-1～C2-4；Fr.C2-2經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮[(30～1)∶1]梯度洗脫，得到3個(gè)組分Fr.C2-2-1～C2-2-3；Fr.C2-2-2經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以甲醇洗脫，得到化合物Ⅲ(3.5 mg)；Fr.C2-2-3經(jīng)半制備型高效液相色譜分離，以22%乙腈-水洗脫得到化合物Ⅱ(8.1 mg，tR=10.1 min)和化合物Ⅸ(2.6 mg，tR=11.3 min)。

Fr.D(30.4 g)經(jīng)MCI柱色譜分離，以90%甲醇-水洗脫，得到4個(gè)組分Fr.D1～D4。Fr.D1(13.2 g)經(jīng)硅膠(400 g，100～200目)柱色譜分離，以石油醚-丙酮[(50～1)∶1]梯度洗脫，得到8個(gè)組分Fr.D1-1～D1-8；Fr.D1-2經(jīng)硅膠(50 g)柱色譜分離，以石油醚-丙酮(5∶1)等度洗脫，得到化合物Ⅷ(15.6 mg)；Fr.D1-4經(jīng)硅膠(80 g，80～100目)柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯[(30～1)∶1]梯度洗脫，后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(1∶1)洗脫，得到化合物Ⅰ(7.6 mg)。

Fr.F(130.0 g)經(jīng)MCI柱色譜分離，以90%甲醇-水洗脫，得到3個(gè)組分Fr.F1～F3。Fr.F1(0.9 g)經(jīng)RP-C18柱色譜分離，以甲醇-水(10%～100%)梯度洗脫，得到3個(gè)組分Fr.F1-1～F1-3；Fr.F1-1經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅵ(1.1 g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：白色無(wú)定形粉末。分子式C27H28N2O4，分子量444。1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ：7.72(2H，m，H-2′，7′)，7.52(1H，tt，J=7.5 Hz、2.0 Hz，H-5′)，7.44(2H，brt，J=7.4 Hz，H-4′，6′)，7.26(5H，m，H-5～9)，7.15(2H，m，H-5″，7″)，7.07(2H，td，J=6.5 Hz、1.7 Hz，H-4″，8″)，6.84(1H，d，J=7.7 Hz，N-H)，6.03(1H，d，J=8.6 Hz，N-H)，4.77(1H，td，J=8.1 Hz、6.0 Hz，H-2)，4.33(1H，m，H-1″)，3.92(1H，dd，J=11.3 Hz、4.9 Hz，H-9″a)，3.81(1H，dd，J=11.3 Hz、4.2 Hz，H-9″b)，3.21(1H，dd，J=13.7 Hz、6.0 Hz，H-3a)，3.06(1H，dd，J=13.7 Hz、8.5 Hz，H-3b)，2.75(2H，m，H-2,2″)，2.02(3H，s，-COCH3)；13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ：170.4(C-1)，55.0(C-2)，38.4(C-3)，136.6(C-4)，128.8(C-5，9)，129.3(C-6，8)，127.1(C-7)，167.2(C-1′)，133.6(C-2′)，128.6(C-3′，7′，4″，8″)，127.0(C-4′，6′)，131.9(C-5′)，49.5(C-1″)，37.4(C-2″)，136.7(C-3″)，129.1(C-5″，7″)，126.7(C-6″)，64.6(C-9″)，COCH3(170.8，20.8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為金色酰胺醇酯。

化合物Ⅱ：白色無(wú)定形粉末。分子式C9H7NO，分子量145。1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ：9.88(1H，s，-CHO)，8.16(1H，brd，J=7.6 Hz，H-4)，8.09(1H，s，H-2)，7.47(1H，brd，J=8.1 Hz，H-7)，7.26(2H，m，H-5，6)；13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ：139.7(C-2)，120.1(C-3)，122.4(C-4)，123.6(C-5)，124.9(C-6)，113.1(C-7)，139.0(C-8)，125.7(C-9)，187.4(-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為吲哚醛。

化合物Ⅲ：黃色油狀物。分子式C11H11NO2，分子量189。1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ：8.05(1H，brd，J=8.4 Hz，H-4)，7.95(1H，s，H-2)，7.43(1H，brd，J=7.7 Hz，H-7)，7.19(2H，m，H-5，6)，4.35(2H，q，J=7.1 Hz，OCH2CH3)，1.41(3H，t，J=7.1 Hz，OCH2CH3)；13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ：133.1(C-2)，108.5(C-3)，122.5(C-4，5)，123.7(C-6)，112.9(C-7)，138.1(C-8)，127.3(C-9)，167.5(C-10),OCH2CH3(60.8，14.8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為吲哚-3-甲酸乙酯。

化合物Ⅳ：白色針狀結(jié)晶(氯仿)。分子式C29H46O，分子量410。1HNMR(500 MHz, CDCl3)，δ：5.34(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.24(1H，dd，J=15.2 Hz、8.2 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J=15.2 Hz、7.4 Hz，H-23)，4.68(2H，m，H2-26)，3.52 (1H，m，H-3)，2.42(1H，q，J=6.3 Hz，H-24)，2.03(1H，m，H-20)，1.97(1H，m，H-8)，1.95(1H，m，H-2a)，1.85(1H，m，H-2b)，1.83(1H，m，H-1a)，1.68(1H，m，H-16a)，1.64(3H，brs，CH3-27)，1.49(6H，overlapped，H-11a，15a和H2-7，28)，1.25(2H，overlapped，H-16b，17)，1.15(2H，m，H2-12)，1.08(3H，overlapped，H-1b，14，15b)，1.00(6H，overlapped，CH3-19，21)，0.83(3H，t，J=7.3 Hz，CH3-29)，0.69(3H，s，CH3-18)；13CNMR(125 MHz, CDCl3)，δ：37.3(C-1)，31.7(C-2)，71.8(C-3)，42.3(C-4,13)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，31.9(C-7,8)，50.2(C-9)，36.5(C-10)，21.1(C-11)，39.7(C-12)，56.9(C-14)，24.3(C-15)，28.7(C-16)，55.9(C-17)，12.1(C-18)，19.4(C-19)，40.2(C-20)，20.2(C-21)，137.2(C-22)，130.0(C-23)，52.0(C-24)，148.6(C-25)，109.5(C-26)，20.8(C-27)，25.7(C-28)，12.2(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為(24S)-ethylcholesta-5,22(E),25-trien-3β-ol。

化合物Ⅴ：白色無(wú)定形粉末。分子式C29H50O，分子量414。1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ：5.30(1H，brd，J=5.4 Hz，H-6)，3.48(1H，m，H-3)，0.96(3H，s，CH3-19)，0.88(3H，d，J=6.6 Hz，CH3-21)，0.80(6H，overlapped，CH3-27，29)，0.77(3H，d，J=6.9 Hz，CH3-26)，0.64(3H，s，CH3-18)；13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ：37.3(C-1)，31.6(C-2)，71.8(C-3)，42.3(C-4，13)，140.8(C-5)，121.7(C-6)，31.9(C-7,8)，50.1(C-9)，36.5(C-10)，21.1(C-11)，39.8(C-12)，56.8(C-14)，24.3(C-15)，28.3(C-16)，56.0(C-17)，12.0(C-18)，19.4(C-19)，36.2(C-20)，19.0(C-21)，33.9(C-22)，29.1(C-23)，45.8(C-24)，26.0(C-25)，18.8(C-26)，19.8(C-27)，23.0(C-28)，11.9(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物Ⅵ：無(wú)色針狀結(jié)晶(氯仿)。分子式C35H60O6，分子量576。1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:5.33(1H，brd，J=5.2 Hz，H-6)，4.22(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，3.63(1H，m，H-6′a)，3.44(1H，m，H-3)，3.40(1H，dd，J=11.8 Hz、5.9 Hz，H-6′b)，3.17(1H，m，H-3′)，3.05(1H，m，H-5′)，3.01(1H，m，H-4′)，2.89(1H，td，J=8.3 Hz、4.9 Hz，H-2′)，2.34(1H，m，H-4a)，2.12(1H，m，H-4b)，0.96(3H，s，CH3-19)，0.90(3H，d，J=6.4 Hz，CH3-21)，0.83(3H，d，J=6.7 Hz，CH3-29)，0.80(6H，m，CH3-26，27)，0.65(3H，s，CH3-18)；13CNMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:37.9(C-1)，30.3(C-2)，77.9(C-3)，39.5(C-4)，141.5(C-5)，122.3(C-6)，32.4(C-7,8)，50.7(C-9)，37.3(C-10)，21.7(C-11)，40.5(C-12)，42.9(C-13)，57.2(C-14)，24.9(C-15)，28.9(C-16)，55.5(C-17)，12.7(C-18)，20.0(C-19)，36.6(C-20)，19.7(C-21)，34.4(C-22)，26.4(C-23)，46.2(C-24)，29.9(C-25)，20.2(C-26)，20.8(C-27)，23.7(C-28)，12.8(C-29)，101.8(C-1′)，73.5(C-2′)，78.0(C-3′)，71.1(C-4′)，78.2(C-5′)，62.1(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為胡蘿卜苷。

化合物Ⅶ：粉色油狀物。分子式C40H56，分子量536。1HNMR(500 MHz，CDCl3)，δ：1.97(12H，s，CH3-19，19′，20，20′)，1.72(6H，s，CH3-18，18′)，1.03(12H，s，CH3-16，16′，17，17′)；13CNMR(125 MHz，CDCl3)，δ：34.3(C-1，1′)，39.7(C-2，2′)，19.3(C-3，3′)，33.1(C-4，4′)，129.4(C-5，5′)，137.9(C-6，6′)，126.7(C-7，7′)，137.8(C-8，8′)，136.1(C-9，9′)，132.4(C-10，10′)，130.1(C-11，11′)，137.3(C-12，12′)，136.5(C-13，13′)，130.9(C-14，14′)，125.1(C-15，15′)，29.0(C-16，16′,17，17′)，21.8(C-18，18′,19，19′)，12.8(C-20，20′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為β-胡蘿卜素。

化合物Ⅷ：白色針狀結(jié)晶(甲醇)。分子式C7H8O2，分子量124。1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ：7.16(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.74(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，4.47(2H，s，H2-7)；13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ：157.9(C-1)，116.1(C-2，6)，129.8(C-3，5)，133.5(C-4)，65.1(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為對(duì)羥基苯甲醇。

化合物Ⅸ：白色針狀結(jié)晶(甲醇)。分子式C7H6O4，分子量154。1HNMR(500 MHz，CD3OD)，δ：7.21(1H，d，J=3.1 Hz，H-6)，6.96(1H，dd，J=8.9 Hz、3.1 Hz，H-4)，6.78(1H，d，J=8.9 Hz，H-3)；13CNMR(125 MHz，CD3OD)，δ：113.3(C-1)，150.8(C-2)，115.3(C-3)，125.1(C-4)，156.0(C-5)，119.0(C-6)，171.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為2,5-二羥基苯甲酸。

化合物Ⅰ～Ⅸ的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅸ的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of compounds Ⅰ-Ⅸ

2.2 討論

從斑籽木地上部分90%乙醇提取物中分離鑒定的9個(gè)化合物中有3個(gè)生物堿類(lèi)(Ⅰ～Ⅲ)、3個(gè)甾體類(lèi)(Ⅳ～Ⅵ)、1個(gè)四萜類(lèi)(Ⅶ)和2個(gè)酚類(lèi)(Ⅷ和Ⅸ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ為首次從斑籽木屬植物中分離得到?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，化合物Ⅷ對(duì)羥基苯甲醇能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性腦血栓形成，且具有顯著的抗炎作用，其抗炎作用機(jī)制與抑制花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝途徑有關(guān)[17]。另有研究表明，對(duì)羥基苯甲醇在體內(nèi)外均具有顯著的抗血小板聚集活性，其作用機(jī)制可能與抑制外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放有關(guān)[18]。此外，化合物Ⅸ2,5-二羥基苯甲酸對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性具有明顯的抑制作用[19]。

3 結(jié)論

采用正相硅膠柱色譜、MCI柱色譜、半制備型高效液相色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜等分離方法從斑籽木地上部分90%乙醇提取物中分離得到9個(gè)化合物，分別鑒定為：金色酰胺醇酯(Ⅰ)、吲哚醛(Ⅱ)、吲哚-3-甲酸乙酯(Ⅲ)、(24S)-ethylcholesta-5,22(E),25-trien-3β-ol(Ⅳ)、β-谷甾醇(Ⅴ)、胡蘿卜苷(Ⅵ)、β-胡蘿卜素(Ⅶ)、對(duì)羥基苯甲醇(Ⅷ)、2,5-二羥基苯甲酸(Ⅸ)，其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ為首次從斑籽木屬植物中分離得到。該研究為斑籽木藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步闡明奠定了基礎(chǔ)，并為其臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。