趙久華，鄭舒婷，林鳳屏，王正朝

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007 2皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽六安 237005

1968年，Lobel等[1]首先發(fā)現(xiàn)在牛黃體中存在白細(xì)胞，隨后研究還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞減少可以導(dǎo)致黃體功能障礙[2-4]。目前，越來(lái)越多的證據(jù)表明多種類(lèi)型的免疫細(xì)胞存在于黃體中，如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等，參與黃體功能的調(diào)節(jié)，且在黃體的整個(gè)生命周期中發(fā)揮著重要作用[1-4]。

在哺乳動(dòng)物黃體中，不僅存在不同類(lèi)型的黃體細(xì)胞，而且還存在著不同類(lèi)型的T細(xì)胞，這些T細(xì)胞均來(lái)源于骨髓造血干細(xì)胞[5-6]。在胸腺中，造血祖細(xì)胞通過(guò)分裂生成未成熟的胸腺細(xì)胞，成熟的胸腺細(xì)胞被釋放到外周組織。另外，胸腺功能是維持小鼠卵巢正常功能所必需的，先天性的或后天切除的無(wú)胸腺動(dòng)物是不孕的且卵巢功能異常[6]。先天性免疫系統(tǒng)細(xì)胞起源于骨髓干細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。這些細(xì)胞進(jìn)入卵巢后，參與卵巢排卵和黃體功能的調(diào)節(jié)過(guò)程[7-9]。Kizuka等[10]用小鼠骨髓移植模型演示了綠色熒光蛋白(green fluorescrent protein，GFP)標(biāo)記的骨髓細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到黃體中的過(guò)程，這些GFP+細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，表明巨噬細(xì)胞是在黃體成形過(guò)程中從骨髓被轉(zhuǎn)移到卵巢的。脾臟是卵巢的另一種免疫細(xì)胞儲(chǔ)存庫(kù)，Swirski等[11]發(fā)現(xiàn)脾臟是單核細(xì)胞儲(chǔ)存和快速分布部位，機(jī)體可以利用脾臟單核細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥。另外，Oakley等[12]發(fā)現(xiàn)卵巢中的白細(xì)胞數(shù)量與脾臟中的白細(xì)胞數(shù)量呈反比關(guān)系。脾切除的大鼠卵巢中白細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減少，表明脾臟可以作為卵巢白細(xì)胞的直接儲(chǔ)庫(kù)。此外，在切除脾的假孕兔子中，白細(xì)胞數(shù)量和孕酮濃度顯著降低。

由此可見(jiàn)，免疫細(xì)胞在黃體形成及其功能調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用。因此，在本實(shí)驗(yàn)室先前關(guān)于哺乳動(dòng)物卵巢黃體發(fā)育及其功能調(diào)節(jié)的工作基礎(chǔ)上[13-17]，本文綜述了不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞在哺乳動(dòng)物黃體功能維持及其退化過(guò)程中的作用，旨在進(jìn)一步了解黃體生物學(xué)功能，為臨床操控黃體功能提供重要的參考。

免疫細(xì)胞在黃體發(fā)育過(guò)程中的作用

在哺乳動(dòng)物黃體中，T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞是研究相對(duì)較多的免疫細(xì)胞。因此，我們分別概述這些免疫細(xì)胞在黃體發(fā)育及其功能維持中的作用。

T淋巴細(xì)胞在牛黃體中，T淋巴細(xì)胞的類(lèi)型和CD4+/CD8+T細(xì)胞的數(shù)量從早期黃體階段到晚期黃體階段均沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而且Poole等[18]發(fā)現(xiàn)牛黃體中T淋巴細(xì)胞的比例為：25% CD4+T細(xì)胞、45% CD8+T細(xì)胞和30% γδ+T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)女性外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)可以刺激體外培養(yǎng)的黃體細(xì)胞產(chǎn)生孕酮，且中期黃體細(xì)胞主要誘導(dǎo)γδ+T細(xì)胞的增殖，同時(shí)白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的表達(dá)增加[19-21]。由此可見(jiàn)，功能性黃體可以通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10對(duì)黃體中T淋巴細(xì)胞的增殖發(fā)揮免疫抑制作用。孕酮可以誘導(dǎo)小鼠γδ+T細(xì)胞合成IL-10和其他的Th2相關(guān)因子[21]，表明在功能性黃體中，黃體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間可以通過(guò)孕酮相互影響。另外，黃體細(xì)胞雖然可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的增殖，但這些細(xì)胞沒(méi)有核孕酮受體，只表達(dá)膜孕酮受體。因此，孕酮對(duì)T淋巴細(xì)胞的作用表現(xiàn)為快速且特異性方式。

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞單核細(xì)胞起源于骨髓干細(xì)胞，通過(guò)血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到特定組織，并根據(jù)組織微環(huán)境的情況分化為巨噬細(xì)胞，從而參與多種生理過(guò)程。在人、牛和豬的早期黃體中，巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增多。Turner等[22]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在維持黃體血管完整性過(guò)程中具有非常重要的作用，巨噬細(xì)胞漸進(jìn)性消除與卵巢出血有關(guān)，從而導(dǎo)致黃體內(nèi)皮細(xì)胞耗竭和紅細(xì)胞增多。Care等[23]發(fā)現(xiàn)由于妊娠黃體微血管網(wǎng)的破壞，引起巨噬細(xì)胞耗竭，血漿孕酮下降，導(dǎo)致胚胎植入停滯。另外，與顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)的外周血巨噬細(xì)胞具有促黃體形成作用。人單核細(xì)胞與黃體細(xì)胞共培養(yǎng)可增加白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)的釋放，而單核細(xì)胞有IL-8受體，所以黃體細(xì)胞條件性培養(yǎng)基可以通過(guò)IL-8刺激單核細(xì)胞的遷移[24]。黃體細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的相互作用有助于黃體早期趨化因子釋放和白細(xì)胞募集的增加[25]?？梢?jiàn)，巨噬細(xì)胞在維持卵巢血管完整性中起著非常重要的作用。

多形核白細(xì)胞在一些物種黃體中發(fā)現(xiàn)了多形核白細(xì)胞(polymorphonuclear leukocytes，PMN)，如中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞[24-27]。人血循環(huán)白細(xì)胞的60%是中性粒細(xì)胞，在急性炎癥反應(yīng)初期的非特異性階段起重要作用。在牛黃體早期階段，中性粒細(xì)胞數(shù)量和IL-8濃度相當(dāng)高，人黃體中中性粒細(xì)胞數(shù)量也相當(dāng)高，且大鼠妊娠黃體早期階段，中性粒細(xì)胞數(shù)量同樣很高。早期黃體的形成可以誘導(dǎo)PMN遷移，且IL-8可以刺激黃體內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)管樣結(jié)構(gòu)的形成[26]。重要的是，IL-8可以有效地刺激黃體細(xì)胞產(chǎn)生孕酮，這與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)和纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)的體外作用一樣[26-27]?？梢?jiàn)，IL-8和中性粒細(xì)胞可以刺激黃體的形成與發(fā)育。PMN和IL-8在體內(nèi)和體外均可以誘導(dǎo)血管的增生，表明PMN和IL-8不僅在組織炎癥誘導(dǎo)和傷口愈合中起作用，而且在黃體血管增生調(diào)節(jié)中起作用[27]。在小鼠子宮內(nèi)膜微血管中檢測(cè)到了表達(dá)VEGF的中性粒細(xì)胞，且在中性粒細(xì)胞耗竭的小鼠中，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖顯著降低[26]。Miyamoto等[27]發(fā)現(xiàn)VEGF對(duì)人中性粒白細(xì)胞具有趨化性作用，且可以被VEGF抗體的中和作用所阻斷。另外，F(xiàn)GF2也可以增加大鼠中性粒細(xì)胞的募集。在黃體發(fā)育過(guò)程中，檢測(cè)到了高表達(dá)的VEGF和FGF2[29]，表明IL-8、VEGF和FGF2作為PMN募集的刺激因子，在黃體早期階段發(fā)揮著協(xié)同作用。

嗜酸性粒細(xì)胞通常參與由寄生蟲(chóng)感染、哮喘和過(guò)敏性疾病引起的免疫應(yīng)答，在人、牛和綿羊排卵后不久嗜酸性粒細(xì)胞就會(huì)滲透進(jìn)入黃體，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的P選擇蛋白被募集到正在發(fā)育的黃體中[34]。在人黃體發(fā)育早期階段，黃體細(xì)胞表達(dá)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子RANTES(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)，表明它們?cè)谘茉錾皖?lèi)固醇激素合成中的重要調(diào)控作用[34]。另外，地塞米松可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量減少，并導(dǎo)致孕酮濃度變低。

樹(shù)突狀細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是先天性免疫和適應(yīng)性免疫所必需的細(xì)胞，可以引發(fā)T細(xì)胞特異性抗原呈遞[30]。越來(lái)越多的證據(jù)表明DC參與了抗原免疫反應(yīng)和抗原免疫耐受的誘導(dǎo)[30-31]。例如，在胚胎第4.5天，短暫消融DC將導(dǎo)致胚胎完全被吸收，表明DC在胎兒免疫耐受中起至關(guān)重要的作用。盡管牛黃體中是否存在DC尚未得到證實(shí)，但在小鼠卵巢中存在DC，且在黃體形成過(guò)程中不斷累積[31]。另外，條件性消除DC可以阻斷人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)誘導(dǎo)的排卵，干擾淋巴管的發(fā)育，并顯著抑制孕酮分泌[32]。由此可見(jiàn)，在黃體發(fā)育過(guò)程中，DC主要位于新形成的早期階段黃體，并參與孕酮合成和淋巴管生成的過(guò)程。

其他血小板是在凝血系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的血細(xì)胞，能夠產(chǎn)生誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的化學(xué)引誘物，參與傷口愈合和組織重塑的過(guò)程。Furukawa等[33]發(fā)現(xiàn)位于人早期黃體中的血小板，參與黃體發(fā)育，上調(diào)孕酮合成。

雖然免疫細(xì)胞在黃體發(fā)育過(guò)程中的作用已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但其調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，如黃體免疫系統(tǒng)與妊娠識(shí)別和妊娠建立之間的關(guān)系尚不清楚。值得關(guān)注的是，目前的資料已經(jīng)表明免疫細(xì)胞不僅參與了黃體的形成及發(fā)育過(guò)程，而且還參與卵巢黃體功能的調(diào)節(jié)。

免疫細(xì)胞在黃體退化過(guò)程中的作用

子宮來(lái)源的或者外源的前列腺素F2α(prostaglandin F2α，PGF2α)啟動(dòng)黃體退化，并迅速減少黃體孕酮分泌。在人、牛、豬、馬和小鼠等黃體退化過(guò)程中，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明這兩種類(lèi)型的細(xì)胞在黃體退化過(guò)程中具有重要作用[35-37]。

T淋巴細(xì)胞在黃體退化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了大量的CD4+和CD8+T細(xì)胞，表明這兩種類(lèi)型的T細(xì)胞在黃體退化過(guò)程中起重要作用[20]。在體外，激活的PBMC可以抑制黃體生成素(luteinizing hormone，LH)刺激黃體細(xì)胞分泌孕酮。Cannon等[38]發(fā)現(xiàn)PGF2α給藥后分離的黃體細(xì)胞比PGF2α給藥前分離的黃體細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖的刺激作用更強(qiáng)，外源孕酮可以抑制T細(xì)胞增殖。在反芻動(dòng)物循環(huán)T淋巴細(xì)胞中，γδ+T細(xì)胞占大部分，如γδ+T細(xì)胞占牛黃體T淋巴細(xì)胞的35%。Walusimbi等[39]發(fā)現(xiàn)退化的黃體細(xì)胞主要誘導(dǎo)γδ+WCl+T細(xì)胞的增殖，而功能性黃體細(xì)胞主要誘導(dǎo)γδ+WCl-T細(xì)胞的增殖。另外，功能性的黃體細(xì)胞增加了表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL-10的γδ+T細(xì)胞比例，但降低了表達(dá)黃體退化因子IFN-γ(interferon gamma，干擾素-γ)的γδ+T細(xì)胞比例[39]。因此，功能性黃體的微環(huán)境抑制了固有T細(xì)胞活性，而退化的黃體微環(huán)境則恢復(fù)了這些T細(xì)胞活性，促進(jìn)了黃體組織結(jié)構(gòu)的消亡。在胚胎植入期間，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞)對(duì)免疫耐受調(diào)節(jié)至關(guān)重要[40]。牛黃體中CD4+Foxp3+T細(xì)胞比外周血中更多，但使用PGF2α后退化黃體中Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量大大減少[18]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞可以調(diào)節(jié)固有T細(xì)胞的功能，防止黃體開(kāi)始退化。因此，F(xiàn)oxp3+T細(xì)胞數(shù)量的減少直接與黃體退化有關(guān)。

巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞是功能性黃體所必需的，但在黃體退化早期階段也出現(xiàn)了大量的巨噬細(xì)胞[23-25]。在牛黃體退化過(guò)程中，70%的增殖細(xì)胞是CD14+巨噬細(xì)胞。在兔黃體退化過(guò)程中，X4+和D68+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加。另外，炎性細(xì)胞因子(如TNF-α，IL-1b和IFN-γ)和趨化因子(如CCL2)也參與了黃體退化。這些因子可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞積聚在黃體中，產(chǎn)生炎癥和免疫應(yīng)答，促進(jìn)黃體退化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[41-43]。因此，黃體主要通過(guò)凋亡損失細(xì)胞，發(fā)生退化，且凋亡的黃體細(xì)胞會(huì)被巨噬細(xì)胞吞噬。一般來(lái)說(shuō)，巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞可以根據(jù)外部刺激條件產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，增加免疫炎癥反應(yīng)，并與外周固有細(xì)胞進(jìn)行交流，如IL-1s、IL-2、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IFN-α、IFN-γ和前列腺素[23-25]。關(guān)于巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞與這些細(xì)胞因子之間的關(guān)系已有許多研究，如TNF-α蛋白存在于牛黃體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中，可以增加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性、抑制孕酮分泌、誘導(dǎo)IFN-γ和Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[44]。另外，IFN-γ還可以抑制LH刺激黃體細(xì)胞合成孕酮，增加前列腺素的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞是最早被募集到炎癥部位的細(xì)胞，從而提供細(xì)胞因子和蛋白水解酶。在PGF2α誘導(dǎo)牛黃體退化過(guò)程中，中性粒細(xì)胞被迅速募集到黃體中，這個(gè)過(guò)程大約5 min[45-46]。同樣，PGF2α給藥后中性粒細(xì)胞迅速在馬黃體中積累。為了產(chǎn)生這種快速反應(yīng)，PGF2α直接刺激P選擇蛋白表達(dá)，并通過(guò)P選擇蛋白增強(qiáng)中性粒細(xì)胞黏附在黃體內(nèi)皮細(xì)胞中[45-46]。急性炎癥的特征在于中性粒細(xì)胞在幾分鐘內(nèi)迅速滲透并且持續(xù)出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移。中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子來(lái)募集T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，如IL-8，TNF-α和IFN-γ[41-43]。PGF2α使用后6～24 h的牛黃體中，發(fā)現(xiàn)了大量的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞被認(rèn)為是黃體組織快速消亡所必需的[45-46]。由此可見(jiàn)，PGF2α誘導(dǎo)的黃體退化與急性炎癥反應(yīng)有關(guān)，伴隨著急性遷移的中性粒細(xì)胞，這些細(xì)胞招募其他免疫細(xì)胞到正在退化的黃體中。CD18抗體預(yù)處理不僅可以顯著抑制PGF2α誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞積累，而且還可以顯著抑制血清孕酮濃度的降低[23-25]。N-甲酰基-甲硫氨酰-L-亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)激活大鼠中性粒細(xì)胞后，與黃體細(xì)胞共同孵育，可以顯著減少LH刺激黃體細(xì)胞積累cAMP和分泌孕酮，這取決于中性粒細(xì)胞的數(shù)量[41-43]。然而，Talbott等[47-49]利用IL-8和PMA激活中性粒細(xì)胞，然后再與牛黃體細(xì)胞共培養(yǎng)，并沒(méi)有減少孕酮分泌。因此，滲入牛黃體中的中性粒細(xì)胞可能是黃體功能性退化的啟動(dòng)因子，而不是誘導(dǎo)因子。

目前的資料已經(jīng)表明免疫細(xì)胞除了參與黃體發(fā)育的過(guò)程外，還直接參與黃體退化的過(guò)程，但這些不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞在黃體退化過(guò)程中作用方式及其分子調(diào)控尚有待進(jìn)一步研究。

總結(jié)與展望

在哺乳動(dòng)物，黃體的生理功能是合成并分泌大量的孕酮，在胚胎的命運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用。在卵巢排卵之后，黃體細(xì)胞分泌各種趨化因子和細(xì)胞因子，募集免疫細(xì)胞到正在發(fā)育的黃體中，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。在黃體早期發(fā)育階段，這些免疫細(xì)胞通過(guò)釋放IL-8、PGE2、VEGF和FGF2，增加孕酮分泌。這些招募的免疫細(xì)胞和黃體細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可以刺激血管增生和淋巴管生成。另外，子宮PGF2α是黃體退化的起始信號(hào)，募集各種免疫細(xì)胞進(jìn)入黃體，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。PGF2α可以促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1和IFN-γ)和趨化因子(如CCL2和IL-8)的產(chǎn)生，這些因子可以募集巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞進(jìn)入黃體，并通過(guò)炎癥和免疫反應(yīng)增強(qiáng)黃體退化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，抑制血管增生和誘導(dǎo)血管收縮可以誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致孕酮分泌減少、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞吞噬。進(jìn)一步研究黃體血管病學(xué)和免疫學(xué)的功能調(diào)控機(jī)制，將有助于豐富我們對(duì)生殖生理學(xué)與卵巢生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。