裴云山，張 偲，劉曉黎，成 凱，張則婷*，李從剛

1.中國(guó)科學(xué)院生物磁共振分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，波譜與原子分子物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院 精密測(cè)量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院），湖北 武漢 430071；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

引 言

α-突觸核蛋白（α-synuclein，αsyn）是一種突觸前神經(jīng)元蛋白，在正常生理?xiàng)l件下以天然無結(jié)構(gòu)可溶性的單體形式存在[1,2]．病理學(xué)研究表明，帕金森癥（Parkinson’s disease，PD）患者大腦中葉存在大量黑質(zhì)神經(jīng)元路易小體（Lewy bodies，LB），其主要成分是異常聚集形成纖維的αsyn，這也將αsyn 與PD 等神經(jīng)退行性疾病密切關(guān)聯(lián)[3-9]．αsyn 含有140 個(gè)氨基酸殘基，按照氨基酸序列及其性質(zhì)可以分為三個(gè)區(qū)域：（1）1～60 號(hào)殘基組成的N 端區(qū)域，此區(qū)域主要是膜、分子伴侶和其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)[10-12]；（2）61～95 號(hào)殘基組成的非淀粉樣成分（non-amyloid component，NAC）區(qū)域，被認(rèn)為是αsyn 聚集的必需區(qū)域[13]；（3）96～140 號(hào)殘基組成的C 端區(qū)域，該區(qū)域富含酸性氨基酸，是蛋白質(zhì)、金屬離子和聚胺等的結(jié)合位點(diǎn)[14-16].

前期研究表明分子伴侶，如熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、熱激同源蛋白70（heat shock cognate 70，HSC70）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）等，能夠與αsyn 的N 端結(jié)合，防止αsyn 的錯(cuò)誤折疊和異常聚集，尤其是PDI 甚至能反向解聚初步形成的αsyn 纖維[17]，這顯示了伴侶蛋白在阻止αsyn 聚集并調(diào)節(jié)αsyn 生理功能中起到重要作用[11,18-22]．PDI是一種多功能性應(yīng)激蛋白，幾乎存在于所有組織細(xì)胞中，如神經(jīng)組織中的丘腦中腦細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、上皮組織的腺上皮細(xì)胞等[23]．晶體結(jié)構(gòu)顯示，PDI 的abb'xa'c 等結(jié)構(gòu)域以U 型排列[24]．其中，同源結(jié)構(gòu)域a 和a'都包含一個(gè)活性位點(diǎn)CGHC 基序，該位點(diǎn)主要負(fù)責(zé)催化氧化還原反應(yīng)中二硫鍵的重排[25]；b 和b'同源結(jié)構(gòu)域則形成一個(gè)大的疏水表面，主要負(fù)責(zé)識(shí)別與結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白或未折疊蛋白[26]．在功能方面，PDI 是一種主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的關(guān)鍵酶和伴侶蛋白[27]，負(fù)責(zé)催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生蛋白的二硫鍵氧化還原反應(yīng)，并協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊[28,29]．PDI 還可以預(yù)防內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊相關(guān)的神經(jīng)毒性．有研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者的大腦中存在功能失調(diào)的S-亞硝基化PDI（SNO-PDI），亞硝基化修飾抑制了PDI 正常參與蛋白折疊反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊等，進(jìn)而引起神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[23,30]．

有研究[31]表明，PDI 的a'結(jié)構(gòu)域在體外能有效抑制αsyn 聚集，PDI 通過與αsyn 的N 端（尤其是His50 殘基）相互作用抑制αsyn 形成纖維[22]，但是PDI 識(shí)別αsyn 的機(jī)制仍不明確．雖然Yagi-Utsumi等[32]通過液體核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）及X 射線晶體衍射等手段闡述了Humicola insolensPDI（HiPDI）與人源αsyn 多肽的結(jié)合方式，但HiPDI 與人源PDI 在序列和結(jié)構(gòu)上都存在著明顯的差異.因此研究人源伴侶蛋白PDI 識(shí)別αsyn 并影響其纖維化的機(jī)理仍至關(guān)重要.

NMR 技術(shù)是研究生物大分子間相互作用的有效方法[33,34]，比如液體NMR 技術(shù)能夠準(zhǔn)確提供生物大分子間殘基水平的作用位點(diǎn)信息．本文利用NMR 方法和硫黃素T（thioflavin T，ThT）纖維化熒光實(shí)驗(yàn)研究了人源PDI ab、PDI b'xa'和PDI 與αsyn 的相互作用及其對(duì)αsyn 聚集過程的影響，并采用NMR 滴定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了αsyn 識(shí)別PDI b'xa'結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)．基于以上結(jié)果通過HDOCK 在線平臺(tái)對(duì)接服務(wù)構(gòu)建了PDI 結(jié)合αsyn 的分子模型，探討并提出了PDI 抑制αsyn 聚集的作用機(jī)理．本研究有助于我們進(jìn)一步了解PD，從而為后續(xù)的疾病預(yù)防及治療提供一定的理論基礎(chǔ)．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、K2HPO4、NaH2PO4、NaCl、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；咪唑、2-嗎啉乙磺酸（MES）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、1,6-己二醇購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；標(biāo)記所需的同位素15NH4Cl 和鎖場(chǎng)溶劑D2O 均購(gòu)于Cambridge Isotope Laboratories；αsyn 1-19 多肽MDVFMKGLSKAKEGVAAA 和αsyn 30-42 多肽AGKTKEGVLYVGS 均購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司，基因測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成.

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

將人源αsyn 全長(zhǎng)蛋白（簡(jiǎn)稱αsyn）的編碼序列克隆到pT7-7 載體上，將N 端含His6-tag 和煙草蝕斑病毒蛋白酶（tobacco etch virus protease，TEV）酶切位點(diǎn)的人源PDI 全長(zhǎng)蛋白（簡(jiǎn)稱PDI）以及PDI b'xa'結(jié)構(gòu)域蛋白（簡(jiǎn)稱PDI b'xa'）的編碼序列克隆到pET-28a 載體上.通過單點(diǎn)突變的方法，成功獲得編碼含有完整N 端區(qū)域的αsyn 1-60 截短體蛋白（簡(jiǎn)稱αsyn 1-60）以及PDI ab 結(jié)構(gòu)域蛋白（簡(jiǎn)稱PDI ab）的質(zhì)粒.

將上述5種質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)大腸桿菌中，并分別于LB 培養(yǎng)基和含15NH4Cl同位素的M9培養(yǎng)基中表達(dá)非標(biāo)記和15N標(biāo)記的各種目的蛋白．在220 rpm、37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8 后，加入終濃度為1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl 1-thio-β-Dgalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)6 h，以過量表達(dá)目的蛋白．

所有收集的菌液于高壓裂菌儀裂解，并在裂解前加入 PMSF 及蛋白酶抑制劑 cocktail（P2714-1BTL）防止目的蛋白降解．αsyn 及PDI b'xa'的純化方法參照文獻(xiàn)[35-38]；αsyn 1-60 經(jīng)SP陽(yáng)離子交換柱（GE Healthcare）初步純化，并于Superdex 75 26/600 分子篩柱（GE Healthcare）進(jìn)行細(xì)分離；PDI 先使用HiLoad Ni 親和柱（GE Healthcare）除去一部分雜蛋白，再上樣至Source Q（GE Healthcare）陰離子交換柱去除剩余大部分雜蛋白，最后上樣至Superdex 75 分子篩柱，純度達(dá)到NMR 實(shí)驗(yàn)要求；PDI ab 通過Ni（GE Healthcare）柱和Superdex 75 分子篩柱兩步純化，純度達(dá)到95%以上．所有目的蛋白都脫鹽至超純水中，凍干備用．

根據(jù)280 nm 處的摩爾消光系數(shù)（Ext.Coefficient: 5 960、1 490、45 380、21 430、23 950 mol?1?cm?1對(duì)應(yīng)于αsyn、αsyn 1-60、PDI、PDI ab 和PDI b'xa'），使用Nanodrop 2000 采集的紫外吸收強(qiáng)度標(biāo)定各蛋白的濃度（https://web.expasy.org/protparam/），并經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行純度分析.

1.3 NMR 譜圖采集及數(shù)據(jù)處理

1H-15N HSQC 實(shí)驗(yàn)樣品的制備：15N 標(biāo)記的凍干αsyn 樣品溶于含20 mmol/L Hepes、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L TCEP，pH=7.0 的緩沖液中，并加入10% (v/v)的D2O，終濃度為0.1 mmol/L．采集1H-15N HSQC 譜圖后，再按等摩爾濃度比例加入非標(biāo)記的PDI 或者PDI ab 或者PDI b'xa'等凍干蛋白并調(diào)整溶液pH，然后再次采集1H-15N HSQC 譜圖.

NMR 滴定實(shí)驗(yàn)樣品的制備：15N 標(biāo)記的凍干PDI b'xa'樣品溶于含20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L TCEP，pH=7.0 的緩沖液中，并加入10% (v/v)的D2O，終濃度為0.2 mmol/L．采集1H-15N TROSY 譜圖后，再以1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4 或1:5 的摩爾濃度梯度比例分別加入非標(biāo)記αsyn 1-19 多肽或者αsyn30-42多肽或者αsyn 1-60 等凍干樣品，調(diào)整溶液pH 后再依次采集1H-15N TROSY 譜圖.

NMR 譜圖在配有5 mm TCI H-C/N-D CryoProbeTM超低溫探頭的Bruker Avance 850 MHz NMR譜儀上采集．1H-15N HSQC 實(shí)驗(yàn)F2維和F1維譜寬分別為12 ppm 和28 ppm，譜中心分別為δH4.70和δN119.0；采樣點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，掃描次數(shù)ns=10；采樣溫度為288 K．1H-15N TROSY 實(shí)驗(yàn)F2維和F1維譜寬分別為12 ppm和35 ppm，譜中心分別為δH4.70和δN119.0；采樣點(diǎn)陣t2×t1=2 048×256，ns=24；采樣溫度為303 K．譜峰指認(rèn)依據(jù)BioMagResBank（entry number 16543 和59363）．二維NMR 數(shù)據(jù)通過NMRPipe[39]處理，使用Sparky[40]軟件分析．

化學(xué)位移擾動(dòng)（chemical shift perturbations，CSPs）通過(1)式[41]計(jì)算：

ΔδH和ΔδN分別代表PDI b'xa' 加入αsyn 1-19 多肽或αsyn 30-42 多肽或αsyn 1-60 后的1H 和15N 化學(xué)位移偏移量.

結(jié)合常數(shù)KD由(2)式[42]擬合得到：

Δδ代表檢測(cè)CSPs 值；Δδmax代表擬合的最大化學(xué)位移變化值；[P]t代表PDI b'xa'的初始濃度，固定為0.2 mmol/L；[L]t代表滴加αsyn 1-19 多肽或αsyn 30-42 多肽或αsyn 1-60 的濃度，最高達(dá)1.0 mmol/L.

1.4 αsyn 聚集監(jiān)測(cè)的ThT 熒光實(shí)驗(yàn)

將凍干的αsyn、PDI、PDI ab 和PDI b'xa'蛋白分別溶于纖維化緩沖液（含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、2 mmol/L TCEP、0.01% (w/v) NaN3，pH=7.5）中至終濃度為0.6 mmol/L，配置濃度為1.5 mmol/L 的ThT 儲(chǔ)液，并利用0.22 μm 濾膜除去可能殘留的不溶物及寡聚體大分子．按照αsyn:PDI /PDI ab/PDI b'xa' = 1:1 的摩爾比例配置αsyn+PDI、αsyn+PDI ab、αsyn+PDI b'xa'混合溶液，單獨(dú)αsyn 對(duì)照組加入等體積緩沖液．每個(gè)混合溶液體系體積為200 μL，再加入2 μL ThT 儲(chǔ)液使ThT終濃度約為15 μmol/L．將混勻后的溶液分別加入到底透黑邊的96 孔板中，每個(gè)樣品孔中再放置1 個(gè)直徑為2.5 mm 的干凈透明玻璃球助勻[43]，使用錫箔紙將96 孔板上層密封以防止長(zhǎng)時(shí)間高溫?fù)]發(fā)，蓋上蓋子后利用SpectroMax i3x 酶標(biāo)儀（Molecular Devices）在37 ℃溫度下高速環(huán)形（orbital）震蕩500 s，之后每10 min 檢測(cè)一次ThT 熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為444 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為482 nm.纖維化聚集所需的半數(shù)時(shí)間t1/2等參數(shù)由(3)式[44]擬合得到：

其中，F(xiàn)(t)是根據(jù)實(shí)驗(yàn)最高ThT 熒光強(qiáng)度歸一化后的熒光值，F(xiàn)0是歸一化后的樣品初始熒光值，A是擬合的到達(dá)平臺(tái)期時(shí)的最大歸一化熒光值，t是纖維生長(zhǎng)時(shí)間，k代表對(duì)數(shù)期時(shí)纖維化生長(zhǎng)速率常數(shù).t1/2經(jīng)Graphpad Prism 9 軟件的單因素方差統(tǒng)計(jì)方法分析.產(chǎn)生纖維的滯后期時(shí)長(zhǎng)t1ag=t1/2?2/k.

2 結(jié)果與討論

2.1 αsyn N 端識(shí)別PDI 的b'xa'結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)

αsyn 作為天然無結(jié)構(gòu)蛋白，其二維1H-15N HSQC 譜峰在1H 維的化學(xué)位移僅分布在7.7～8.5 ppm范圍內(nèi)，而15N 維信號(hào)仍正常分布在105～131 ppm 范圍內(nèi)．前期研究[22]顯示，人源分子伴侶PDI 與αsyn N 端結(jié)合．為研究PDI 與αsyn 相互作用時(shí)PDI 的識(shí)別位點(diǎn)，本文根據(jù)文獻(xiàn)[31,32]報(bào)道及序列分析將PDI 劃分并制備了PDI ab 和b'xa'兩個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白[圖1(a)、(b)]，并分別作用于αsyn．1H-15N HSQC譜圖顯示，與加入PDI 的結(jié)果類似[圖1(d)]，15N 標(biāo)記的αsyn 樣品中加入等量的PDI b'xa'后，位于N 端的交叉峰信號(hào)均產(chǎn)生明顯的化學(xué)位移擾動(dòng)及譜峰強(qiáng)度減弱[圖1(e)、(f)]，表明PDI b'xa'同樣結(jié)合于αsyn 的N 端前20 個(gè)殘基和Tyr39 位點(diǎn)附近約10 個(gè)殘基區(qū)域，與文獻(xiàn)[11,22]報(bào)道的PDI 等伴侶蛋白結(jié)合于αsyn 的N 端結(jié)果一致.值得注意的是，αsyn 滴加PDI 后會(huì)導(dǎo)致溶液pH 發(fā)生變化，如果不調(diào)節(jié)pH，His50 殘基信號(hào)會(huì)產(chǎn)生明顯化學(xué)位移擾動(dòng)（調(diào)節(jié)前約δH8.36/δN125.0，調(diào)節(jié)后約為Hδ8.41/δN125.3）．而如果控制pH 變化在0.1 以內(nèi)，His50 的交叉峰既沒有明顯化學(xué)位移的變化，也沒有信號(hào)強(qiáng)度的降低，這表明在溶液pH 穩(wěn)定時(shí)，PDI 及PDI b'xa'不結(jié)合αsyn 的His50 殘基，His50殘基可作為反應(yīng)過程中的pH 探針[45]．我們推測(cè)，文獻(xiàn)[22]中αsyn 出現(xiàn)的His50 殘基化學(xué)位移擾動(dòng)可能是由于加入PDI 后，溶液（20 mmol/L PBS，pH 6.0）pH 值變化導(dǎo)致．另外，與PDI 相互作用的αsyn 的區(qū)域與通過優(yōu)化最適疏水性（Optimized Matching Hydrophobicity，OMH）法[46]序列疏水性預(yù)測(cè)得到的疏水區(qū)域較為吻合[圖1(g)].

圖1 PDI 的b'xa'結(jié)構(gòu)域與αsyn 的N 端區(qū)域相互作用.PDI（紅色）的(a)一級(jí)序列模型及(b)晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4EKZ）表面圖，粉色和藍(lán)色分別代表PDI ab 與PDI b'xa'結(jié)構(gòu)域；(c) SDS-PAGE 分析各蛋白純度，1～5 泳道分別代表αsyn1-60、αsyn、PDI ab、PDI b'xa'、PDI，M 代表Marker；(d)、(e) αsyn 不加（黑色）與加入等量PDI（紅色）或PDI b'xa'（藍(lán)色）的譜圖疊加，圖中標(biāo)注了明顯發(fā)生信號(hào)減弱或移動(dòng)的殘基；(f)加入等量PDI（紅色）、PDI ab（粉色）、PDI b'xa'（藍(lán)色）后，αsyn 譜峰強(qiáng)度變化（I/I0）；(g)基于OMH 法預(yù)測(cè)αsyn 序列疏水性分析圖，互作區(qū)域或疏水性較強(qiáng)的區(qū)域用灰色標(biāo)出Fig.1 The b'xa' domain of PDI interacts with N-terminal domain of αsyn.(a) Model for PDI (red) primary sequence, PDI ab domain(pink) and PDI b'xa' domain (blue) are shown underneath.(b) Surface crystal structure of human PDI (PDB ID: 4EKZ).(c) Protein purities analyzed by SDS-PAGE.M, Marker; lane 1, αsyn1-60; lane 2, αsyn; lane 3, PDI ab; lane 4, PDI b'xa'; lane 5, PDI.(d) and (e) Spectral overlay of αsyn in the absence (black) and presence of equivalent amount of PDI (red) and PDI b'xa' (blue).Residues showing significant signal attenuation or shifts were marked.(f) Residue-resolved attenuation (I/I0) of αsyn in the presence of PDI (red), PDI ab (pink) and PDI b'xa' (blue).(g) Hydrophobic residues of αsyn predicted by OMH method, the binding and hydrophobic areas are colored gray

但對(duì)比譜峰強(qiáng)度減弱程度可以發(fā)現(xiàn)，αsyn 結(jié)合PDI b'xa'的強(qiáng)度弱于PDI．同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在加入PDI ab 后，譜峰不發(fā)生明顯變化，說明PDI 的ab 區(qū)域不會(huì)與αsyn 結(jié)合[圖1(f)]．

2.2 PDI b'xa'抑制αsyn 聚集的ThT 熒光實(shí)驗(yàn)

ThT 熒光實(shí)驗(yàn)是目前體內(nèi)外研究淀粉樣蛋白纖維化過程最流行的手段之一[47]．它利用游離的ThT 染料結(jié)合纖維化過程中淀粉樣蛋白所形成的β片層后熒光強(qiáng)度大幅增強(qiáng)的特性來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)纖維的生長(zhǎng)過程[48]．我們采用ThT 熒光實(shí)驗(yàn)研究了PDI 各結(jié)構(gòu)域與αsyn 相互作用對(duì)其聚集形成纖維這一過程的影響．

如圖2所示，對(duì)照組αsyn 在約6 h 后逐漸形成纖維；約10 h 后達(dá)到半數(shù)平臺(tái)期水平；約21 h后到達(dá)平臺(tái)期．而加入PDI 后，其產(chǎn)生纖維的滯后期時(shí)長(zhǎng)tlag及達(dá)到半數(shù)平臺(tái)期水平時(shí)長(zhǎng)t1/2均延長(zhǎng)至超過3 倍，分別為約24 h 及35 h．纖維動(dòng)力學(xué)曲線圖及t1/2統(tǒng)計(jì)分析顯示PDI 能有效抑制αsyn 纖維的形成，與文獻(xiàn)[17,22,31,49]報(bào)道的PDI 抑制αsyn 纖維化的結(jié)論一致．而加入PDI ab 的纖維生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組幾乎一致，t1/2統(tǒng)計(jì)分析也表明二者沒有明顯差異．但是加入PDI b'xa'后，αsyn 纖維化生長(zhǎng)曲線顯著被延后，具體表現(xiàn)為tlag由約6 h 延長(zhǎng)至約13 h，t1/2增長(zhǎng)至約23 h．說明PDI b'xa'對(duì)αsyn 的聚集也有明顯的抑制作用，抑制效果約為2 倍，具體參數(shù)如表1所示．但是，此抑制效果與PDI 相比，也顯現(xiàn)出不可忽略的差異（圖2）．

圖2 ThT 熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDI、PDI ab 及PDI b'xa'對(duì)αsyn 聚集的影響.(a) αsyn 不加（黑色）和加入等量PDI ab（粉色）、PDI b'xa'（藍(lán)色）、PDI（紅色）后的纖維生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線；(b)由動(dòng)力曲線擬合得到的纖維生長(zhǎng)達(dá)半數(shù)平臺(tái)期所需時(shí)間t1/2 及其統(tǒng)計(jì)分析，ns 表示無明顯差異，****表示p<0.0001；圓點(diǎn)表示四組平行實(shí)驗(yàn)所求得的數(shù)值Fig.2 The effect on αsyn aggregation of PDI, PDI ab and PDI b'xa' detected by ThT experiment.(a) Aggregations kinetics of αsyn in the absence (black) and presence of equimolar PDI ab (pink), PDI b'xa' (blue) and PDI (red).(b) The fitted half-time (t1/2) values of aggregation and their statistical analysis.ns: not significant, ****: p < 0.0001; the dots represent the values obtained from four parallel experiments

表1 纖維化生長(zhǎng)參數(shù)Table 1 Aggregation kinetics data

以上結(jié)果也表明，PDI 的ab 結(jié)構(gòu)域不與αsyn 相互作用，也不影響αsyn 的聚集．PDI 的b'xa'結(jié)構(gòu)域結(jié)合αsyn 的N 端兩個(gè)區(qū)域，同時(shí)也表現(xiàn)出對(duì)αsyn 聚集的抑制.這與PDI 類似，但PDI b'xa'與αsyn 相互作用的強(qiáng)度以及對(duì)αsyn 聚集的抑制程度均不及PDI．相互作用與纖維化抑制作用同步的現(xiàn)象表明PDI 通過b'xa'結(jié)構(gòu)域與αsyn 相互作用來影響αsyn 的纖維化過程．

2.3 PDI b'xa'蛋白通過疏水空腔識(shí)別αsyn N 端區(qū)域

為了進(jìn)一步研究αsyn 與PDI b'xa'作用的位點(diǎn)，我們將不同濃度的αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽加入至15N 標(biāo)記的PDI b'xa'溶液中，進(jìn)行了NMR 滴定實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，逐漸加入αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽過程中，PDI b'xa'的TROSY 譜圖中部分交叉峰逐漸出現(xiàn)化學(xué)位移變化，這些氨基酸殘基的表觀化學(xué)位移為總體化學(xué)位移的加權(quán)平均，說明PDI b'xa'與αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽的相互作用在液體NMR 的時(shí)間尺度上屬于快交換[圖3(a)、(d)]．進(jìn)一步分析PDI b'xa'譜產(chǎn)生的CSPs 分布發(fā)現(xiàn)，與αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽結(jié)合的區(qū)域?yàn)镻DI 的b'結(jié)構(gòu)域．將上述CSPs 值大于閾值（平均值+標(biāo)準(zhǔn)差）的氨基酸殘基標(biāo)注在PDI b'xa'三維結(jié)構(gòu)上，發(fā)現(xiàn)αsyn 1-19 和αsyn 30-42 多肽主要結(jié)合于PDI b'結(jié)構(gòu)域的I289、I291、I301、L302、I318、L320 等殘基形成的疏水空腔上，另有少數(shù)殘基分散在x linker 及a'結(jié)構(gòu)域表面[圖3(b)、(e)]．

圖3 PDI b'xa'與αsyn N 端相互作用的NMR 檢測(cè).PDI b'xa'（紅色）加入（藍(lán)色）αsyn 1-19 多肽(a)、αsyn 30-42 多肽(d)、αsyn 1-60蛋白(g)的1H-15N TROSY 譜圖，選取E239 殘基展示PDI b'xa'加入各底物后全局殘基化學(xué)位移變化；PDI b'xa'加入αsyn 1-19 多肽(b)、αsyn 30-42 多肽(e)、αsyn 1-60 (h)后的CSPs 柱狀圖，以及根據(jù)CSPs 隨底物αsyn 1-19 多肽(c)、αsyn 30-42 多肽(f)、αsyn 1-60 (i)濃度變化擬合計(jì)算解離常數(shù).柱狀圖中用CSPs 的（平均值+標(biāo)準(zhǔn)差）作為閾值，高于閾值的殘基標(biāo)注在二維譜中，并在b'xa'的晶體結(jié)構(gòu)表面用紅色標(biāo)記；上述高于閾值的殘基通過全局?jǐn)M合得到相應(yīng)解離常數(shù)，離散的擾動(dòng)殘基通過以（平均值+2×標(biāo)準(zhǔn)差）為閾值驗(yàn)證并去除Fig.3 NMR results showing the interaction between PDI b'xa' with the N-terminal domain of αsyn.Overlaid 1H-15N TROSY spectra of PDI b'xa' (red) with (blue) αsyn 1-19 (a), αsyn 30-42 (d) or αsyn 1-60 (g).E239 were selected as representative residues for global chemical shift perturbations (CSPs) during NMR titration.Residue-resolved CSPs of PDI b'xa' during titrations with αsyn 1-19(b), 30-42(e) and 1-60 (h).KD values were fitted from curves of residues with significant CSPs, as a function of αsyn 1-19(c), αsyn 30-42(f), and αsyn 1-60 (i) concentration.Residues showing significant CSPs were marked in spectra and mapped red on the crystal structure surface of PDI b'xa'.Threshold level was indicated as ‘mean+standard deviation’.Disperse residues were verified and removed by the threshold of ‘mean +2×standard deviation’

將上述殘基的化學(xué)位移隨滴定濃度作曲線并通過全局?jǐn)M合得到αsyn 1-19 以及αsyn 30-42 多肽結(jié)合PDI b'xa'的親和力.結(jié)果顯示αsyn 1-19 多肽結(jié)合PDI b'xa'的解離常數(shù)KD約為67.7±9.1 μmol/L，αsyn 30-42 多肽結(jié)合PDI b'xa'的KD約為136.3±16.0 μmol/L [圖3(c)、(f)]，這表明αsyn 的1-19 區(qū)域結(jié)合PDI b'xa'的親和力稍強(qiáng)于30-42 區(qū)域．此外，我們構(gòu)建了含有完整N 端區(qū)域的αsyn 1-60，并研究了其與PDI b'xa'的相互作用．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDI b'xa'與αsyn 1-60 仍表現(xiàn)為快交換的相互作用[圖3(g)]，并且兩者的結(jié)合位點(diǎn)仍集中在PDI 的b'結(jié)構(gòu)域的疏水空腔[圖3(h)]，其解離常數(shù)KD為185.3±14.2 μmol/L [圖3(i)]．

對(duì)比αsyn 1-19 多肽，αsyn 30-42 多肽滴定時(shí)，PDI b'xa'的Thr453 殘基附近產(chǎn)生明顯擾動(dòng)，表明PDI 在行使伴侶功能的過程中，可能需要a'結(jié)構(gòu)域（如Thr453 附近的殘基）輔助b'結(jié)構(gòu)域的疏水口袋結(jié)合αsyn 底物．PDI b'xa'結(jié)合αsyn 1-60 的結(jié)果顯示，Thr453 附近仍存在擾動(dòng)，但程度略輕于αsyn 30-42 多肽．這可能是1-19 號(hào)殘基區(qū)域與30-42 號(hào)殘基區(qū)域均競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PDI b'疏水口袋，但由于1-19 號(hào)殘基區(qū)域結(jié)合PDI b'xa'的親和力強(qiáng)于30-42 號(hào)殘基區(qū)域，因此在αsyn 1-60 結(jié)合PDI b'xa'時(shí)，主要表現(xiàn)為1-19 號(hào)殘基區(qū)域與PDI b'xa'的相互作用，而30-42 號(hào)殘基區(qū)域的Thr453 附近的氨基酸殘基結(jié)合PDI b'xa'的概率相應(yīng)減少，最終表現(xiàn)出Thr453 附近的化學(xué)位移擾動(dòng)減少的現(xiàn)象．這些推論仍需在后續(xù)研究中進(jìn)行確認(rèn)．

2.4 討論

我們的研究結(jié)果顯示，PDI 和PDI b'xa'結(jié)合αsyn 較為疏水的前20 個(gè)殘基和Tyr39 附近區(qū)域[圖1(f)～(g)]．ThT 熒光實(shí)驗(yàn)顯示PDI 和PDI b'xa'均能有效抑制αsyn 聚集，而PDI ab 在溶液中與αsyn沒有相互作用（圖2）．Cheng 等[31]的研究表明，PDI 的c 端截短變體PDI-c 對(duì)αsyn 纖維的抑制作用與PDI 一致．結(jié)合PDI b'xa'對(duì)αsyn 的親和力以及對(duì)聚集的抑制作用都不及PDI 等結(jié)果，表明在PDI 結(jié)合αsyn 過程中，雖然ab 結(jié)構(gòu)域及c 端不參與αsyn 的直接相互作用，但是它們可能增強(qiáng)b'xa'結(jié)構(gòu)域與αsyn 的結(jié)合并促進(jìn)其對(duì)αsyn 聚集的抑制作用.這種促進(jìn)作用可能源于ab 結(jié)構(gòu)域?qū)'xa'結(jié)構(gòu)域疏水口袋的保護(hù)和穩(wěn)定作用[50]，從而使得PDI 比PDI b'xa'更穩(wěn)定且高效結(jié)合底物蛋白αsyn，并使其表現(xiàn)出更強(qiáng)的聚集抑制作用．

結(jié)合NMR 滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果和還原型人源PDI 晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4EKZ），我們使用HDOCK 服務(wù)[51]對(duì)接得到PDI 與αsyn1-40 的結(jié)合模型如圖4(a)所示．最佳對(duì)接模型中，PDI 主要通過b'上的疏水空腔結(jié)合αsyn N 端區(qū)域．對(duì)接模型的局部放大圖顯示，αsyn1-40 蛋白以1～8 號(hào)和37～40 號(hào)的疏水氨基酸殘基將PDI b'上的疏水口袋完全占據(jù)，與我們提出的PDI 結(jié)合αsyn 的方式為疏水相互作用相吻合．Yagi-Utsumi 等[32]的研究結(jié)果顯示，結(jié)合人源αsyn31-41 多肽時(shí)，HiPDI b'xa'以氧化態(tài)形式參與反應(yīng)，還原態(tài)則不能結(jié)合底物．而本研究顯示，人源PDI 及PDI b'xa'在還原條件下均能有效結(jié)合αsyn 并抑制其聚集．然而，由于人源氧化態(tài)PDI 及PDI b'xa'較還原條件下更易發(fā)生多聚[24]，導(dǎo)致無法獲得高質(zhì)量的NMR 譜圖，因此本研究未對(duì)氧化態(tài)PDI 與αsyn 的相互作用展開研究．由于HiPDI 比人源PDI b'結(jié)構(gòu)域的疏水空腔面積小，且序列比對(duì)結(jié)果顯示HiPDI 與人源PDI 的序列相似度不高，疏水口袋b'區(qū)域（237～347 號(hào)氨基酸殘基）序列相似度僅為31.5%．因此結(jié)合αsyn 多肽時(shí)，氧化態(tài)HiPDI 參與相互作用的關(guān)鍵殘基分布與人源PDI 也有所差別[圖4(b)]．但是HiPDI 仍通過b'結(jié)構(gòu)域疏水殘基參與αsyn 多肽的相互作用[32]，與本研究中人源PDI 通過b'結(jié)構(gòu)域的疏水空腔結(jié)合αsyn 的結(jié)果相似（圖4），表明兩種不同來源的PDI 都以疏水相互作用結(jié)合αsyn 底物．

圖4 PDI 與αsyn N 端的疏水結(jié)合模式.(a) PDI 結(jié)合αsyn 1-40 多肽的對(duì)接模型（左）及其結(jié)合區(qū)域的局部放大圖（右），HDOCK對(duì)接實(shí)驗(yàn)在網(wǎng)站服務(wù)器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/）上運(yùn)行，上傳人源PDI 晶體結(jié)構(gòu)，αsyn1-40 序列及NMR 滴定鑒定的結(jié)合位點(diǎn)，最佳對(duì)接結(jié)果使用PyMol 軟件作圖，PDI 表面結(jié)構(gòu)呈灰色，疏水口袋以紅色標(biāo)出，αsyn1-40 卡通結(jié)構(gòu)呈品紅色，右圖中參與結(jié)合的αsyn 殘基以棒狀模式顯示并標(biāo)出．(b)人源PDI b'xa'與HiPDI b'xa'的氨基酸序列比對(duì)．序列一致性和相似性由Clustalw[52]和ESPript 3.0[53]分析所得，相似氨基酸（黑色字母填充黃色方框）以及相同氨基酸（白色字母填充紅色方框）分別被標(biāo)出，頂部標(biāo)注人源PDI b'xa'二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，藍(lán)色和綠色星號(hào)分別表示αsyn 結(jié)合人源PDI 和HiPDI 的關(guān)鍵疏水氨基酸殘基Fig.4 Hydrophobic binding mode of PDI with the N-terminal domain of αsyn.(a) Docking model of PDI binding αsyn1-40 (left panel)and a local zoom view of binding area (right panel).The relevant residues of αsyn1-40 involving in binding PDI were depicted as magenta sticks.HDOCK experiments were performed on the web server (http://hdock.phys.hust.edu.cn/) by uploading human PDI crystal structure,amino acid sequences of αsyn1-40 and their binding sites identified by NMR titration.Optimal docking results were plotted with PyMol software, PDI molecular surface was colored gray and its hydrophobic pocket was marked in red, the magenta cartoon represented αsyn1-40 structure.(b) Alignment of amino acid sequence of human PDI b'xa' from HiPDI b'xa'. Sequence identity and similarity were calculated by Clustalw[52] and ESPript 3.0[53].Similar amino acids were showed as black letters in yellow boxes and identical amino acids were showed as white letters in red boxes.The secondary structural domains were indicated on the top of the sequences.Blue and green asterisks represented the key hydrophobic residues of αsyn interacting with human PDI and HiPDI, respectively

文獻(xiàn)[54]顯示，Tyr39 位點(diǎn)附近的區(qū)域被認(rèn)為是αsyn 聚集過程中的主控單元，缺少或突變Tyr39位點(diǎn)附近區(qū)域中的位點(diǎn)影響αsyn 的聚集，結(jié)合本研究，我們認(rèn)為PDI 抑制αsyn 纖維化聚集的主要機(jī)制在于PDI b'xa'通過b'結(jié)構(gòu)域上I289、I291、I301、L302、I318、L320 等疏水氨基酸殘基形成的疏水空腔結(jié)合αsyn 的N 端的兩個(gè)區(qū)域，這種相互作用可能減少了αsyn 單體間的接觸幾率，也減弱主控單元Tyr39 附近區(qū)域?qū)Ζ羢yn 聚集的控制作用，進(jìn)而抑制了αsyn 的纖維化．

3 結(jié)論

本文通過液體NMR 技術(shù)研究了伴侶蛋白PDI 與αsyn 的相互作用，發(fā)現(xiàn)與αsyn 相互作用的區(qū)域是PDI 的b'xa'結(jié)構(gòu)域．ThT 熒光實(shí)驗(yàn)顯示PDI b'xa'能夠抑制αsyn 的聚集．NMR 滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDI 識(shí)別αsyn 并與其相互作用的位點(diǎn)主要位于PDI b'結(jié)構(gòu)域上I289、I291、I301、L302、I318、L320 等殘基形成的疏水口袋．另外，我們通過HDOCK 對(duì)接構(gòu)建了人源PDI 結(jié)合αsyn N 端區(qū)域的模型．本文還提出了人源伴侶蛋白PDI 通過b'xa'結(jié)構(gòu)域疏水結(jié)合αsyn N 端區(qū)域從而抑制其纖維化聚集的機(jī)制．這一研究為理解伴侶蛋白與αsyn 的相互作用以及伴侶蛋白抑制αsyn 蛋白聚集提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

致謝

感謝國(guó)家自然科學(xué)基金（21673284，21773300）的支持.

利益沖突

無