吳 昊，黃 震，李 磊

(1.恩施州中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，湖北 恩施 445000；2.恩施慧宜中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕醫(yī)院骨與關(guān)節(jié)外科，湖北 恩施 445000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，可引起局部炎癥反應(yīng)、軟骨損傷和軟骨結(jié)構(gòu)改變。如果治療不及時(shí)，不僅會(huì)影響患者的日常生活，還會(huì)增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。OA的特點(diǎn)是關(guān)節(jié)軟骨變性，細(xì)胞外基質(zhì)丟失，廣泛的纖維化和裂隙，導(dǎo)致軟骨表面完全破壞[2]。非甾體抗炎藥或環(huán)氧合酶-2抑制劑是緩解OA癥狀的常用藥物[3]；而晚期患者需要手術(shù)治療，手術(shù)方式包括關(guān)節(jié)鏡手術(shù)和人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，但行關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者可能伴隨不良的手術(shù)后果以及假體壽命有限[4]。有研究報(bào)道，自體軟骨細(xì)胞移植可能成為關(guān)節(jié)炎和軟骨缺損的新治療策略[5]。然而，由于OA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前尚無(wú)有效的對(duì)癥治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞凋亡是OA進(jìn)展的關(guān)鍵因素[6]。了解軟骨細(xì)胞凋亡的潛在分子機(jī)制可能是找到治療OA新靶點(diǎn)的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA，已成為人類疾病的關(guān)鍵調(diào)控因子。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA可能在OA進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如lncRNA MIR4435-2HG在OA中下調(diào)，并調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡[7]；lncRNA HOTAIR通過(guò)靶向調(diào)控miR-130a-3p影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和調(diào)控炎癥反應(yīng)[8]。LncRNA鋅指蛋白反義鏈1(zinc finger protein antisense strand 1，ZFAS1)是一種致癌基因，在大多數(shù)組織中都有表達(dá)[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZFAS1可能通過(guò)靶向Wnt3a信號(hào)通路促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖和遷移[11]。然而，lncRNA ZFAS1在OA進(jìn)展中的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究探討lncRNA ZFAS1對(duì)OA中軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及其潛在的分子機(jī)制，以期為確定OA的新治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：40302ES20)購(gòu)自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；TRIzol試劑(批號(hào)：15596018)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT溶液(批號(hào)：PB180519)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；PrimeScript RT試劑盒(批號(hào)：RR037A)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體2(transforming growth factor-beta receptor type 2，TGFβR2)抗體(批號(hào)：ab253617)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(批號(hào)：RG027)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)DYNEX Technologies公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；ABI PRISM 7000型定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 樣本收集

收集2018年8月至2020年8月于恩施州中心醫(yī)院進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者軟骨組織樣本共 20份作為OA組，將同期外傷急診截肢患者的正常膝關(guān)節(jié)組織樣本20份作為對(duì)照(Control)組。排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和感染性關(guān)節(jié)炎患者。將組織樣本置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究已獲得恩施州中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(20180720186)，所有患者已簽署對(duì)本研究的知情同意書。

1.3 原代軟骨細(xì)胞分離和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在無(wú)菌條件下去除關(guān)節(jié)軟骨的纖維結(jié)締組織后，將軟骨組織切成1 mm3的大小。隨后加入0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型膠原酶消化細(xì)胞，6 h后將細(xì)胞懸液以1 200 r/min離心10 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾器過(guò)濾5 min。棄去上清液，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將Vector、pcDNA-ZFAS1、pcDNA-ZFAS1+NC mimic、pcDNA-ZFAS1+miR-590 mimic、NC mimic、miR-590 mimic質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，分別命名為Vector組、pcDNA-ZFAS1組、pcDNA-ZFAS1+NC mimic組、pcDNA-ZFAS1+miR-590 mimic組、NC mimic組、miR-590 mimic組，48 h后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h將軟骨細(xì)胞以每孔6×103個(gè)的密度接種于96孔板中。然后每孔加入20 μL的0.5%MTT溶液，孵育軟骨細(xì)胞4 h。棄上清液并加入150 μL二甲基亞砜，充分溶解結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm波長(zhǎng)處的光密度(optical density，OD)值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。用預(yù)冷的PBS洗滌各轉(zhuǎn)染組處理的細(xì)胞，并用胰蛋白酶消化，然后將細(xì)胞重懸在100 μL含有Annexin V-FITC/PI的結(jié)合緩沖液中，室溫下避光孵育15 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 RNA提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

使用TRIzol法提取軟骨組織和細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260～280 nm處的OD值。使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒以cDNA為模板，進(jìn)行目的基因定量和分析。以U6和GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

1.7 Western blot

用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液從細(xì)胞中提取總蛋白。用Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒定量蛋白濃度。將等量的蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳條件為恒壓(80 V、40 min，120 V、50 min)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，電轉(zhuǎn)條件為恒流(200 mA，60 min)。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，并與一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。用含0.05% Tween-20的PBS洗膜后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物試劑盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行可視化，最后用SynGene GeneTools軟件進(jìn)行分析。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ZFAS1和miR-590潛在的結(jié)合位點(diǎn) ，并將序列克隆到pmirGLO雙熒光素酶表達(dá)載體上，構(gòu)建ZFAS1野生型報(bào)告基因重組質(zhì)粒(ZFAS1-WT)。使用相同的方法構(gòu)建ZFAS1突變型報(bào)告基因重組質(zhì)粒(ZFAS1-MUT)。將人胚腎細(xì)胞HEK293T接種在24孔板上培養(yǎng)24 h。然后根據(jù)說(shuō)明書使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將ZFAS1-WT、ZFAS1-MUT和miR-590 mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，即分別為miR-590 mimic和3’UTR-ZFAS1-WT共轉(zhuǎn)染組、miR-590 mimic和3’UTR-ZFAS1-MUT共轉(zhuǎn)染組，NC mimic組為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于熒光素酶活性評(píng)估。使用相同的方法驗(yàn)證miR-590與TGFβR2 3’UTR的靶向結(jié)合，根據(jù)說(shuō)明書使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將TGFβR2-WT、TGFβR2-MUT和miR-590 mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，即分別為miR-590 mimic和3’UTR-TGFβR2-WT共轉(zhuǎn)染組、miR-590 mimic和3’UTR-TGFβR2-MUT共轉(zhuǎn)染組，NC mimic組為對(duì)照。其余方法與上述描述一致。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LncRNA ZFAS1在OA軟骨組織中的表達(dá)

通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OA軟骨組織和正常軟骨組織中l(wèi)ncRNA ZFAS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與Control組比較，OA組軟骨組織中的lncRNA ZFAS1表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

*：與Control組比較，P<0.05

2.2 過(guò)表達(dá)lncRNA ZFAS1對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與Vector組比較，pcDNA-ZFAS1組軟骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNA ZFAS1表達(dá)水平顯著升高，軟骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

a：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA ZFAS1表達(dá)水平；b：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；c：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 *：與Vector組比較，P<0.05

2.3 ZFAS1可直接靶向并調(diào)控miR-590的表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-590與ZFAS1存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，miR-590可能是ZFAS1的作用靶點(diǎn)。與Control組比較，OA組軟骨組織中的miR-590表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與NC mimic組比較，miR-590 mimic和3’UTR-ZFAS1-WT共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-590 mimic和3’UTR-ZFAS1-MUT共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3。

a：ZFAS1與miR-590的結(jié)合位點(diǎn)；b：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn);c：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OA組織中miR-590的表達(dá) *：與NC mimic組比較，P<0.05；#：與Control組比較，P<0.05

2.4 ZFAS1通過(guò)調(diào)控miR-590促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡

與Vector組比較，pcDNA-ZFAS1組軟骨細(xì)胞中miR-590表達(dá)水平顯著降低，軟骨細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與pcDNA-ZFAS1+NC mimic組比較，pcDNA-ZFAS1+miR-590 mimic組軟骨細(xì)胞中miR-590表達(dá)水平顯著升高，軟骨細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-590表達(dá)水平；b：MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；c：細(xì)胞凋亡率；d:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 *：與Vector組比較，P<0.05；#：與pcDNA-ZFAS1+NC mimic組比較，P<0.05

2.5 miR-590可直接靶向并調(diào)控TGFβR2的表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGFβR2與miR-590存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，TGFβR2可能是miR-590的下游靶點(diǎn)。與NC mimic組比較，miR-590 mimic和3’UTR-TGFβR2-WT共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-590 mimic和3’UTR-TGFβR2-MUT共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與NC mimic組比較，miR-590 mimic組細(xì)胞中TGFβR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5。

a：miR-590與TGFβR2的結(jié)合位點(diǎn)；b：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)；c：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGFβR2 mRNA的表達(dá)；d：Western blot檢測(cè)TGFβR2蛋白的表達(dá) *：與NC mimic組比較，P<0.05

2.6 過(guò)表達(dá)ZFAS1通過(guò)調(diào)控miR-590促進(jìn)TGFβR2 mRNA和蛋白的表達(dá)

與Vector組比較，pcDNA-ZFAS1組細(xì)胞中TGFβR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-ZFAS1+NC mimic組比較，pcDNA-ZFAS1+miR-590 mimic組TGFβR2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖6。

a：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGFβR2 mRNA的表達(dá)；b：Western blot檢測(cè)TGFβR2蛋白的表達(dá) *：與Vector組比較，P<0.05；#：與pcDNA-ZFAS1+NC mimic組比較，P<0.05

3 討論

OA是一種異質(zhì)性疾病，影響所有滑膜關(guān)節(jié)，如脊柱、髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)，其特征是關(guān)節(jié)軟骨逐漸退化，伴繼發(fā)性滑膜炎和骨骼重塑。高齡是OA的主要危險(xiǎn)因素，此外，肥胖和遺傳等因素也可影響OA的發(fā)展。OA的分子機(jī)制目前尚未完全闡明，研究顯示細(xì)胞外基質(zhì)破壞、炎癥反應(yīng)或軟骨細(xì)胞凋亡與OA的進(jìn)展密切相關(guān)[12-13]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA是OA的生物調(diào)節(jié)因子，可作為OA早期預(yù)防、臨床診斷和治療的生物標(biāo)志物。許多l(xiāng)ncRNA的異常表達(dá)參與軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解、增殖和凋亡。如lncRNA HOTAIR通過(guò)上調(diào)FUT2促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解和軟骨

細(xì)胞凋亡[14]。LncRNA SNHG5通過(guò)調(diào)節(jié)miR-10a-5p/H3F3B軸促進(jìn)OA中軟骨細(xì)胞增殖并抑制其凋亡[15]。有研究報(bào)道ZFAS1參與多種癌癥(如結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌)的發(fā)生發(fā)展[16-18]。此外，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，ZFAS1還可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬[19]。但lncRNA ZFAS1在OA發(fā)展中的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，ZFAS1在OA軟骨組織中表達(dá)下調(diào)，表明ZFAS1可能參與OA的進(jìn)展。為了進(jìn)一步探討ZFAS1在OA中的作用，本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)ZFAS1處理軟骨細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡能力，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ZFAS1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

研究表明，lncRNA在生物學(xué)或病理學(xué)過(guò)程中充當(dāng)miRNA的海綿并調(diào)節(jié)其功能。如lncRNA HOTAIR通過(guò)miR-20a-5p/HMGA2軸影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[20]。敲低lncRNA MFI2-AS1可通過(guò)miR-130a-3p/TCF4軸抑制脂多糖誘導(dǎo)的OA進(jìn)展[21]。ZFAS1靶向miR-548e增強(qiáng)CXCR4表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)ZFAS1潛在的靶基因，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-590是ZFAS1的靶基因。有研究報(bào)道，miR-590可通過(guò)不同的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展，包括胰腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌[23-25]。此外，在OA中，miR-590可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，miR-590在OA患者中的表達(dá)顯著上調(diào)，為了進(jìn)一步研究miR-590在ZFAS1調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中的功能，將pcDNA-ZFAS1與miR-590 mimic共轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中，結(jié)果顯示pcDNA-ZFAS1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而miR-590 mimic轉(zhuǎn)染后可顯著逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。以上數(shù)據(jù)表明ZFAS1可通過(guò)靶向miR-590促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。因此，本研究認(rèn)為ZFAS1可以作為miR-590的分子海綿在OA進(jìn)展中發(fā)揮作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明TGF-β參與了OA的發(fā)展。TGF-β在OA中上調(diào)，從而提高軟骨細(xì)胞活性和蛋白多糖合成以促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)[27]。TGFβR2作為一種跨膜絲氨酸-蘇氨酸激酶，是啟動(dòng)下游TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要因子，可能在OA進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。如敲除TGFβR2后，在小鼠模型中出現(xiàn)明顯的OA樣表型[28]。CircSERPINE2通過(guò)調(diào)節(jié)miR-495/TGFβR2軸抑制OA中軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解[29]。本研究結(jié)果顯示，TGFβR2是miR-590的下游靶基因。ZFAS1過(guò)表達(dá)后TGFβR2 mRNA和蛋白水平顯著增加，而miR-590 mimic轉(zhuǎn)染后可以逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。表明lncRNA ZFAS1通過(guò)miR-590/TGFβR2軸促進(jìn)OA進(jìn)展。

綜上所述，lncRNA ZFAS1在人OA軟骨組織中下調(diào)。此外，ZFAS1通過(guò)海綿吸附miR-590并誘導(dǎo)TGFβR2的表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制凋亡，提示ZFAS1/miR-590/TGFβR2軸可作為OA患者治療的新靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討了lncRNA ZFAS1在OA中的作用機(jī)制，由于OA臨床表型相對(duì)復(fù)雜，病程較長(zhǎng)，因此還需要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA ZFAS1對(duì)OA進(jìn)展的影響。